甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系花期幾種酶活性的比較

吳則東,王華忠,韓英

(1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150501）

甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系花期幾種酶活性的比較

吳則東1,2,王華忠1,2,韓英1,2

(1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150501）

利用穩(wěn)定的甜菜雄性不育系1A、2A為材料，以其相應(yīng)的保持系1B、2B為對照，在花期取花和葉為試材，對超氧化物歧化酶（雜OD）、過氧化物酶（POD）及過氧化氫酶（CAT）3種酶的活性與甜菜雄性不育的關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，甜菜不育性的表現(xiàn)僅和花蕾中POD和雜OD的活性降低有關(guān)；而CAT活性在花蕾和葉片中不育系和保持系之間均無明顯差異。

甜菜；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；酶活性

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytop1asmic ma1e steri1ity，CMS)是廣泛存在于高等植物中的一種自然現(xiàn)象。迄今已在200多種高等植物中發(fā)現(xiàn)了CMS。它受細(xì)胞質(zhì)基因和細(xì)胞核基因的雙重控制，是一種不能產(chǎn)生有活力花粉的母性遺傳性狀［1］。植物雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑，并在生產(chǎn)上取得了很大的成功，如我國雜交水稻種植面積占水稻總面積的46%～55%，其產(chǎn)量比常規(guī)品種增產(chǎn)20%～30%，同樣在甜菜育種上雜種優(yōu)勢利用也很廣泛。自20世紀(jì)60年代末美國就已經(jīng)普遍種植雄性不育甜菜單胚雜交種。目前，世界50多個栽培甜菜的國家中除5～6個仍然在使用多胚種外，其余國家甜菜生產(chǎn)中已經(jīng)全部采用單胚雄性不育雜交種。我國對甜菜雄性不育系的選育和利用起步較晚，20世紀(jì)70年代初期才開始進(jìn)行這方面的研究，對于甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育產(chǎn)生原因的研究比較少。從發(fā)育生物學(xué)的觀點(diǎn)看，多細(xì)胞生物的發(fā)育過程可以看作是一系列基因在時間和空間上依次表達(dá)的過程，不同器官的分化是在一定條件下基因順序表達(dá)的結(jié)果［2］。同工酶是基因表達(dá)的次級反應(yīng)，它們是生物體不同個體、同一個體不同組織器官或生長發(fā)育的不同階段上存在一系列功能相同，但結(jié)構(gòu)上略有差異的酶，利用同工酶分析能較直接地判斷基因的存在及其表達(dá)規(guī)律[3]。

植物雄性不育性與酶活性的關(guān)系，已在小麥、辣椒、蘿卜、油菜、玉米和高粱等作物中進(jìn)行了廣泛的研究。有人認(rèn)為在小孢子發(fā)育中，酶作用過程的方向和強(qiáng)度的改變引起新陳代謝的紊亂，從而導(dǎo)致淀粉、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的含量減少或新陳代謝停止，引起雄性不育[4]。甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系某些酶活性差異的研究在國內(nèi)已有報(bào)道，如孫立險[5]分析了甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系四分體期、單核期、雙核期中的POD同工酶，白薇等[6]以甜菜3個細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其相應(yīng)保持系為材料，對營養(yǎng)生長階段葉片中的POD、CAT和酸性磷酸酯酶活性進(jìn)行了研究。但是對甜菜雄性不育系、保持系花期POD、CAT及SOD活性進(jìn)行比較研究的還未見有報(bào)道。本研究以穩(wěn)定的不育系1A、2A及其同源保持系1B、2B為材料，探索3種酶活性和甜菜雄性不育的關(guān)系，為甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育性的生理機(jī)理研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所以國外引進(jìn)的成對甜菜單胚不育材料為不育源，利用國產(chǎn)優(yōu)良的多胚保持系作輪回父本對其同步回交改良，并自交5代以上而育成的生物學(xué)及經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀均優(yōu)并穩(wěn)定遺傳的甜菜單胚雄性不育系和保持系。該試驗(yàn)以2對甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其相應(yīng)保持系為材料，不育系代號為1A、2A，相應(yīng)保持系為1B、2B，母根栽植時間是2005年4月21日，取樣時間為6月15日(開花期），各材料分別選取30株生長健壯的個體，每株取5個上位葉片及5個未開放的花蕾作為試驗(yàn)材料，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室，蒸餾水沖洗干凈后用紙吸干，稱取鮮樣各1g，放置在超低溫冷凍冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測定方法

1.2.1 酶的提取取樣品1份，放入冰浴的研缽中，加少量石英砂，加pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(內(nèi)含2%的聚乙烯吡咯烷酮）約5mL，迅速研成勻漿，4℃時5000r/min離心15min，取上清迅速放入50mL容量瓶中，最后用緩沖液定容至刻度，放置在4℃時冰箱中備用。

1.2.2 酶活性的測定活性的測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[7]，在OD560下以抑制NBT光化還原的50%表示為1個酶活性單位(U)；CAT活性采用紫外吸收法測定[7]，以每分鐘OD240變化0.1為1個酶活性單位(U)；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[8]，以每分鐘OD470增加0.01作為1個酶活性單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜菜雄性不育系和保持系SOD活性的比較

花期供試材料葉片及花蕾SOD活性分析結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，在開花期葉片中SOD酶的活性均表現(xiàn)為不育系高于保持系，且1A是1B的1.1倍，方差分析表明，達(dá)到顯著水平(P<0.05），2A是2B的1.03倍，未達(dá)到顯著水平(P>0.05）；花蕾中SOD的活性表現(xiàn)為保持系均高于不育系，且1B中SOD的活性是1A的1.13倍，2B中SOD的活性是2A的1.06倍，均達(dá)到顯著水平。

2.2 甜菜雄性不育系和保持系CAT活性的比較

生殖生長期供試材料花蕾及葉片CAT活性分析結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，在花期葉片和花蕾中，均表現(xiàn)為1B高于1A，2A高于2B，兩對不育系和保持系間CAT活性之間呈現(xiàn)出相反的趨勢，說明CAT的活性和甜菜不育的關(guān)系不大。

2.3 甜菜雄性不育系和保持系POD活性的比較

生殖生長期供試材料葉片及花蕾POD活性分析結(jié)果如圖3，從圖3可以看出，在葉片中，表現(xiàn)為1A中POD的活性高于1B，2B中POD的活性高于2A，兩對不育系和保持系POD活性之間呈現(xiàn)出相反的趨勢；在花蕾中則均表現(xiàn)為保持系POD的活性高于不育系，其中1B是1A的2.53倍，2B是2A的1.84倍，均達(dá)到極顯著水平。

圖1 不育系與保持系花期SOD活性比較

圖2 不育系與保持系花期CAT活性比較

圖3 不育系與保持系花期POD活性比較

3 討論

3.1 SOD：SOD普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶，對于保護(hù)植物、清除超氧陰離子自由基具有重要的意義，從試驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，在花蕾中兩對材料間保持系的SOD活性均高于不育系，且差異顯著，說明不育系SOD活性的降低可能使植物代謝中產(chǎn)生的超氧自由基等有毒物質(zhì)分解降低，使這些有害物質(zhì)穿透生物膜，導(dǎo)致膜脂過氧化的加劇，結(jié)果使花粉敗育。

3.2 CAT：CAT是植物體內(nèi)的活性氧清除酶類，能夠清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的有害物H2O2，本試驗(yàn)結(jié)果表明，CAT在甜菜整個生殖階段不育系和保持系之間差異性不強(qiáng)，尤其是在花期的葉片和花蕾中，兩對材料之間沒有一致性的規(guī)律，因此認(rèn)為，CAT的活性和甜菜不育的關(guān)系不大。

3.3 POD：POD是一種含鐵卟琳的線粒體外末端氧化酶，在植物組織內(nèi)廣泛存在。它一方面與組織的呼吸和物質(zhì)的氧化等生理生化過程密切相關(guān)，同時又是清除活性氧的酶保護(hù)系統(tǒng)的重要成員之一，因此，在呼吸代謝和氧自由基清除中有積極功能。POD在植物組織中具有氧化1AA的作用，不育系POD活性的增高必然導(dǎo)致組織1AA含量的降低，這與前人在棉花[9]、榨菜[10]等的研究結(jié)果相一致，說明POD活性的增強(qiáng)在花粉的敗育中具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，甜菜在生殖生長階段葉片中POD活性在不育系和保持系之間未表現(xiàn)出一致性的規(guī)律，只有到花期的花蕾中才表現(xiàn)出保持系POD活性均高于不育系，且差異極顯著，因此認(rèn)為不育系中POD活性的降低，導(dǎo)致活性氧增加可能與小孢子的敗育有關(guān)。

植物的一切生理生化過程都是在酶的作用和參與下完成的，而且酶是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，按照一個基因編碼一個同工酶亞基的理論，可以由同工酶的差異直接推測基因型的不同，因此探討酶的作用有著十分重要的意義。本試驗(yàn)中的兩對同型不育系和保持系是經(jīng)過多年系統(tǒng)選育而成的，具有穩(wěn)定的遺傳性，其不育株與可育株的遺傳基礎(chǔ)基本上是相同的，僅在育性上表現(xiàn)不同。因此，不育株與可育株在活性上的差異，與核內(nèi)不育基因的表達(dá)有關(guān)。因此兩系間同工酶的差異表達(dá)，有可能引起代謝紊亂，導(dǎo)致雄性器官不育發(fā)生。因此從3種酶活性與甜菜不育性的關(guān)系可以看出，甜菜不育性的表現(xiàn)僅和花蕾中POD和SOD的活性降低有關(guān)，而和CAT活性無關(guān)，說明甜菜雄性不育的基因可能僅在花蕾中表達(dá)，而不在葉片中表達(dá)。但是，與小麥、水稻的生理生化機(jī)制的研究相比，甜菜雄性不育的生理生化機(jī)制研究落后甚遠(yuǎn)，還需進(jìn)一步深入研究。

［1］賴錦盛，戴景瑞，謝友菊，等.植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的分子基礎(chǔ)研究[A].作物雄性不及雜種優(yōu)勢研究進(jìn)展(1)[C].北京.中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：82-86.

［2］A1pert P，Lumaret R，Guisto F D.Popu1ation structure inferred from a11ozyme ana1ysis in the c1ona1 herb，F(xiàn)ragaria chiloensis (Rosaceace)[J].Amer.J.Bot.，1993，80(9).1002-1006.

［3］王中仁.植物遺傳多樣性和系統(tǒng)學(xué)研究中的等位酶分析[J].生物多樣性，1994，2(1).38-43.

［4］李殿榮.甘藍(lán)型油菜雄性不育系、保持系、恢復(fù)系選育成功并大面積推廣[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1986(4).94.

［5］孫立險.甜菜雄性不育系及保持系的過氧化物酶同工酶初步分析[J].中國甜菜，1986，(4).21-25.

［6］白薇，田自華，蓋連玉，等.甜菜胞質(zhì)雄性不育系與其保持系某些酶活性的差異[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2004，19(4).70-73.

［7］鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003

［8］王金勝.實(shí)用生物化學(xué)技術(shù)[M].太原.山西高校聯(lián)合出版社，1994.119-135.

［9］黃晉玲，楊鵬，李炳林.棉花晉A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系酶活性的研究[J].棉花學(xué)報(bào)，2004，16(4).229-232.

［10］胡美華，陳竹君，汪炳良.榨菜胞質(zhì)雄性不育系及其保持系若干生化特性的比較[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24(1).57-58.

Several Anthesis Enzyme Activities of Sugarbeet CMS and Maintainer Lines

WU Ze-dong1，2，WANG Hua-zhong1，2，HAN Ying1，2
(1.The Key Laboratory of Sugarbeet Genetic Breeding,Heilongjiang University,Harbin 150080,China; 2.Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150501,China)

The activities of the enzyme SOD，POD and CAT in 1eaves and f1ower buds of cytop1asmic ma1e steri1ity(CMS)sugarbeet 1ines 1A and 2A and their maintainers 1B and 2B purified for generations was ana1yzed on f1owers and 1eafs during Anthesis.The resu1ts showed that the expression of CMS sugarbeet re1ated to the decrease of POD and SOD activities，there was a significant difference in activities of SOD and POD between CMS and their maintainer 1ines in f1ower buds，but there was no significant1y different to activity of CAT.It showed that the genes re1ated to cytop1asmic ma1e steri1ity probab1y expressed in the reproductive organ and it had no effect on the nutritive organ.

Sugarbeet;Cytop1asmic ma1e steri1ity;Enzyme activities

雜566.301

A

1007-2624(2009）01-0027-02

2007-05-29

國家“863”項(xiàng)目(2001AA241192）。

吳則東(1972-），男，黑龍江省依蘭縣人，助理研究員，主要從事甜菜遺傳育種的研究。