冰梨酒釀酒酵母的篩選

趙國(guó)群，張曉騰，趙一凡，關(guān)軍鋒*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北石家莊050051）

冰梨酒釀酒酵母的篩選

趙國(guó)群1，張曉騰1，趙一凡1，關(guān)軍鋒2*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北石家莊050051）

以鴨梨為原料，榨汁后經(jīng)冷凍濃縮制成濃縮梨汁（即冰梨汁），接入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在15℃下進(jìn)行低溫酒精發(fā)酵釀制成冰梨酒。通過比較8株釀酒酵母的發(fā)酵性能，及其所釀冰梨酒的理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量和感官品質(zhì)，最終確定釀酒酵母R2為釀制冰梨酒的適宜菌種。該酵母生長(zhǎng)繁殖快、降糖和產(chǎn)酒精能力強(qiáng)、發(fā)酵性能優(yōu)良；釀出的冰梨酒酒香和諧，果香純正，口感甜美醇厚、柔和爽口，具有冰梨酒特有的風(fēng)味。

冰梨酒；釀酒酵母；酒精發(fā)酵；篩選

冰酒一般是指推遲鮮果采收時(shí)間，將其在自然低溫（-7～-10℃）條件下冰凍，然后采摘、榨汁、發(fā)酵釀成的果酒?！吨袊?guó)葡萄釀酒技術(shù)規(guī)范》中對(duì)冰葡萄酒的定義是：將葡萄推遲采收，在氣溫低于-7℃條件下，使葡萄在樹枝上保持一定時(shí)間，使其結(jié)冰，然后采收、壓榨，用此葡萄汁釀成的酒[1-2]。冰葡萄酒由于其獨(dú)特濃郁的醇厚甜香風(fēng)味和口感，加上對(duì)原料的苛刻要求和繁復(fù)、嚴(yán)謹(jǐn)、漫長(zhǎng)的發(fā)酵過程使其成為葡萄酒中的極品，更被譽(yù)為“液體黃金”[3]。借鑒冰葡萄酒的概念和釀造工藝，采用人工冷凍技術(shù)，其他果實(shí)釀制的冰酒也有了很大的發(fā)展，并已經(jīng)開發(fā)出藍(lán)莓冰酒[4]、樹莓冰酒[5]、沙棘冰酒[6]和荔枝冰酒[7]等。梨果肉質(zhì)細(xì)脆，含糖量高，香甜爽口，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有各種蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和多種維生素等，是釀造果酒的良好原料[8]。但目前鮮有冰梨酒的報(bào)道。

冰酒原料的高糖、高酸環(huán)境以及發(fā)酵過程中低溫條件要求所采用的酵母能耐高糖、耐低溫。酵母種類對(duì)冰酒發(fā)酵過程中乙酸和甘油的形成、冰酒的感官特性有顯著影響。由于高滲環(huán)境引起酵母菌的脅迫，3-磷酸甘油脫氫酶1（glycerol phosphate dehydrogenase，GPD1）和3-磷酸甘油酯酶2（glycerol phosphatase，GPP2）在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，促使代謝流轉(zhuǎn)向甘油合成途徑并在胞內(nèi)積累以平衡外界滲透壓，高滲透壓也正向調(diào)節(jié)酵母菌乙醛脫氫酶活性，促使乙酸的合成，因而冰酒中甘油和乙酸含量比普通酒多[9-10]。甘油能改善改善葡萄酒的甜味、酒體與豐滿度[11]。乙酸約占冰酒中揮發(fā)酸的90%，高揮發(fā)酸會(huì)使冰酒出現(xiàn)腐敗味，降低冰酒的價(jià)值[12]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)冰葡萄酒釀造菌種進(jìn)行了篩選。ERASMUS D J等[13]比較了7種商品釀酒酵母的發(fā)酵性能，發(fā)現(xiàn)菌株R-HST、N96和EC1118產(chǎn)乙酸量少，適合冰葡萄酒的生產(chǎn)；裴廣仁等[14]比較了9種商業(yè)葡萄酒酵母，發(fā)現(xiàn)菌株WY3最適合冰葡萄酒生產(chǎn)。釀酒酵母種類對(duì)于冰酒的生產(chǎn)及品質(zhì)至關(guān)重要，目前尚未見冰梨酒專用酵母的報(bào)道。本研究以鴨梨為原料，榨汁后經(jīng)冷凍濃縮制成濃縮梨汁，接種釀酒酵母后在低溫條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵，比較不同的釀酒酵母的發(fā)酵性能及冰梨酒的理化指標(biāo)和感官品質(zhì)，以期篩選出一株適合于釀造冰梨酒的釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨梨：河北省趙縣產(chǎn)；耐低溫釀酒酵母R2、R-HST、EC1118、K1、DV10、71B：上海杰兔工貿(mào)有限公司；釀酒酵母RW：湖北安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母KD10：本實(shí)驗(yàn)室保存。酵母粉、葡萄糖、蛋白胨等生化試劑：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ-E6螺桿式榨汁機(jī)：九陽股份有限公司；ZXSD-A1090生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；安捷倫6820高效氣相色譜儀：美國(guó)惠普公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母種子液的制備

釀酒酵母R2、R-HST、EC1118、K1、DV10、71B、RW：配制5%的葡萄糖水，以100∶1（mL∶g）比例加入干酵母粉，35℃下活化30 min。

釀酒酵母KD10：在100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，接入2～3環(huán)斜面保藏的酵母菌株，在30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.3.2 冰梨汁的制備

選擇新鮮無病的成熟鴨梨，清水洗凈、去核后榨汁。利用不同濃度溶液的冰點(diǎn)不同，溶液濃度越低冰點(diǎn)越高，即先結(jié)冰部分溶液較稀，去除冰晶可將溶液濃縮的原理，將壓榨后的鴨梨汁放置于-18℃冰箱冷凍室中冷凍至完全結(jié)冰，然后在4℃冷藏室中進(jìn)行解凍，去除冰塊，收集先溶解的部分果汁，并測(cè)定可溶性固形物含量，再放入冷凍室冷凍，然后解凍，如此重復(fù)多次，最后獲得濃縮的鴨梨汁，即為冰梨汁。經(jīng)測(cè)定，冰梨汁中還原糖含量360 g/L、總酸含量3.75 g/L。

1.3.3 冰梨酒的發(fā)酵

將300 mL冰梨汁加入500 mL的三角瓶中，加入360 μL 100 g/L偏重亞硫酸鉀溶液（SO2終質(zhì)量濃度60 mg/L），接入釀酒酵母種子液，接種量均為1×106CFU/mL，用8層干凈的紗布封口，在15℃生化培養(yǎng)箱中靜置，進(jìn)行酒精發(fā)酵。定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)、還原糖含量和總酸。待發(fā)酵液酒精含量約12%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，補(bǔ)180 μL 100 g/L偏重亞硫酸鉀溶液終止發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，用硅藻土過濾，所得到的澄清酒液即為冰梨酒，裝瓶后冷藏。檢測(cè)冰梨酒的理化指標(biāo)及有機(jī)酸，并對(duì)冰梨酒的感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.4 分析方法

（1）發(fā)酵液酵母活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液酵母活菌數(shù)[15]。

（2）冰梨酒理化指標(biāo)測(cè)定

冰梨酒的常規(guī)理化指標(biāo)參照GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》進(jìn)行測(cè)定。有機(jī)酸的測(cè)定：高效液相色譜法[16]；還原糖的測(cè)定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[17]；色度的測(cè)定[18]：冰梨酒經(jīng)0.45 μm孔徑的濾紙過濾，置于1mm的比色杯中，在波長(zhǎng)420nm、520nm和620nm處測(cè)定其吸光度值，分別記作A420nm、A520nm和A620nm，三者相加即為該冰梨酒色度。

（3）冰梨酒的感官評(píng)價(jià)

挑選10位具有食品評(píng)審經(jīng)驗(yàn)的師生組成評(píng)審小組，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照冰葡萄酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中的規(guī)定，主要從外觀色澤、澄清度、香氣、口味、風(fēng)格幾方面進(jìn)行評(píng)定，滿分100分，感官得分以平均值計(jì)。具體感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 冰梨酒的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of ice pear wine

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵性能比較

2.1.1 生長(zhǎng)能力

冰酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)間過長(zhǎng)，將會(huì)加大發(fā)酵醪感染雜菌的機(jī)會(huì)，并影響發(fā)酵設(shè)備的利用率，這就要求所使用的釀酒酵母在高糖、高酸及低溫條件下有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。一般冰葡萄汁含糖量320～360 g/L、總酸80～120 g/L[19]，而本研究所使用的冰梨汁糖含量360 g/L、總酸含量3.75 g/L，因此，冰梨汁僅是高糖而非高酸環(huán)境。對(duì)8株酵母菌株的生長(zhǎng)能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。由表2可知，8株酵母菌接種到冰梨汁后，由于受到低溫和高糖環(huán)境的影響，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)總體比較緩慢，但不同酵母菌株的生長(zhǎng)能力仍有明顯的差異（P＜0.05）。菌株EC1118和K1在發(fā)酵6 d時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，而其余菌株在4 d時(shí)即達(dá)到最大值。菌株DV10的最大活菌數(shù)最高，為32.7×107CFU/mL；而菌株71B最大活菌數(shù)最低，僅為13.4×107CFU/mL，這表明菌株DV10耐低溫、耐高滲的能力最強(qiáng)。從酵母菌體總的生長(zhǎng)性能進(jìn)行比較可知，菌株DV10生長(zhǎng)能力最好，其次為菌株R2、K1。

表28 株酵母菌的生長(zhǎng)能力比較Table 2 Comparison of the growth ability of eight yeast strains

2.1.2 降糖及產(chǎn)酒精能力

比較8株酵母發(fā)酵冰梨汁第14天時(shí)的殘?zhí)呛考熬凭?，結(jié)果見表3。由表3可知，不同酵母菌株的降糖能力和產(chǎn)酒精能力有著較大的差異。菌株DV10降糖速度最快，所產(chǎn)生的酒精最多，表明該菌株在低溫和高滲條件下代謝轉(zhuǎn)化糖的能力和產(chǎn)酒精能力均較強(qiáng)；其次是菌株R2、RW。從表3還可看出，盡管發(fā)酵結(jié)束時(shí)冰梨酒的酒精度均達(dá)到12%vol，滿足了GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》對(duì)冰酒酒精度的要求，但8株酵母的發(fā)酵周期明顯不同。菌株DV10的發(fā)酵周期最短，僅為14 d，其原因可能與該菌株生長(zhǎng)速度快、降糖和產(chǎn)酒精能力強(qiáng)有關(guān)；而菌株71B的發(fā)酵周期最長(zhǎng)，達(dá)26 d。從降糖速度、產(chǎn)酒精能力和發(fā)酵周期角度綜合考慮，酵母發(fā)酵能力從強(qiáng)到弱依次為DV10＞EC1118＞R2。

表38 株酵母菌的降糖及產(chǎn)酒精能力比較Table 3 Comparison of the sugar-reducing and alcohol-producing capacity of eight yeast strains

2.1.3 產(chǎn)酸能力

果酒中的有機(jī)酸與果酒的風(fēng)味有很大的關(guān)系，其不僅保持果酒的果香、降低甜度，還可以修飾其他的滋味[20]。梨汁本身含有蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、乳酸等多種有機(jī)酸。釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中不僅會(huì)將糖轉(zhuǎn)化為酒精，而且在其生長(zhǎng)代謝過程還會(huì)產(chǎn)生蘋果酸和琥珀酸等有機(jī)酸[16]。對(duì)8株酵母菌株的產(chǎn)酸能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。由表4可知，與未發(fā)酵的冰梨汁（總酸3.75 g/L）相比，冰梨酒的總酸大幅度增加；其中菌株R-HST發(fā)酵的冰梨酒總酸最高，達(dá)到7.50g/L，是冰梨汁總酸的2倍，而其他7株酵母發(fā)酵的冰梨酒總酸含量很接近，約為冰梨汁的1.7倍，表明這8株酵母菌均有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，其中產(chǎn)酸最強(qiáng)的是菌株R-HST。

表48 株酵母菌的產(chǎn)酸能力比較Table 4 Comparison of acids-producing capacity of eight yeast strains

揮發(fā)酸是影響冰酒口感的重要影響因素之一，其主要化學(xué)成分是乙酸。適量的揮發(fā)酸可以增加冰酒酒體的醇厚，但是過量的揮發(fā)酸會(huì)嚴(yán)重影響冰酒的酒質(zhì)與口感，甚至有令人不愉快的氣味產(chǎn)生[21]。普通葡萄酒中乙酸的閾值是0.2 g/L，最適濃度為0.2～0.7 g/L，在此范圍內(nèi)乙酸可以增強(qiáng)葡萄酒香氣的復(fù)雜性，但超過0.7 g/L后，會(huì)對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生負(fù)面影響[22]；而冰葡萄酒中乙酸的閾值是3.18 g/L[23]。由表4可知，與未發(fā)酵的冰梨汁（揮發(fā)酸0.023 g/L）相比，冰梨酒揮發(fā)酸含量急劇增加，達(dá)到58倍以上；揮發(fā)酸中主要是乙酸，占揮發(fā)酸的95%以上。其中，菌株DV10發(fā)酵的冰梨酒中揮發(fā)酸含量最高，其次是菌株71B，而其他酵母所產(chǎn)揮發(fā)酸量很接近。高含量的揮發(fā)酸是冰酒酸敗的標(biāo)志，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中規(guī)定冰酒揮發(fā)酸的限量為2.1 g/L。實(shí)際上，冰酒的高揮發(fā)酸通常是由于酵母對(duì)高滲脅迫的反應(yīng)，而不是細(xì)菌的腐敗作用[14]。盡管發(fā)酵后冰梨酒中乙酸含量大幅度增加，但揮發(fā)酸含量范圍為1.35～1.51g/L，均符合GB/T25504—2010《冰葡萄酒》中規(guī)定的冰酒揮發(fā)酸限量。裴廣仁等[14]篩選冰葡萄酒釀酒酵母時(shí)，發(fā)現(xiàn)供試酵母發(fā)酵的冰葡萄酒揮發(fā)酸含量為0.87～1.56g/L，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.2 不同酵母發(fā)酵的冰梨酒質(zhì)量指標(biāo)比較

2.2.1 冰梨酒的理化指標(biāo)

對(duì)8株酵母菌發(fā)酵的冰梨酒理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5。由表5可知，菌株R2和R-HST所釀冰梨酒的酒精度低于其他6株菌，但其還原糖含量較高。菌株R-HST所釀冰梨酒的總酸最高，達(dá)到了7.50 g/L；其他7株的總酸差異不顯著。就冰梨酒的揮發(fā)酸含量而言，不同酵母菌所釀冰梨酒差異較大；菌株DV10和71B的揮發(fā)酸含量較高，而菌株R2、R-HST和KD10的揮發(fā)酸含量較低。8株酵母菌所釀冰梨酒的pH值差異不顯著。葡萄酒的主體骨架是由干浸出物含量決定的，干浸出物含量越高，葡萄酒品質(zhì)越好。菌株R2和71B所釀制的冰梨酒干浸出物顯著高于其他菌株。8株菌所釀制的冰梨酒在色度上有明顯的差異。菌株DV10釀制的冰梨酒色度值最高（0.65），其次是菌株EC1118（0.51），而菌株R2釀制的冰梨酒色度值最低（0.33）。8株酵母發(fā)酵的冰梨酒顏色為淺黃至褐黃色，這種顏色差異用目測(cè)即可察覺出。造成這種現(xiàn)象的原因可能與酵母細(xì)胞吸附冰梨酒中酚類物質(zhì)能力不同有關(guān)[24]。從揮發(fā)酸、干浸出物和色度的檢測(cè)結(jié)果分析，菌株R2最適宜用來釀制冰梨酒。

表58 株酵母所釀的冰梨酒理化指標(biāo)Table 5 Physicochemical indexes of ice pear wines brewed by eight yeast strains

2.2.2 冰梨酒中有機(jī)酸

有機(jī)酸的種類、含量和比例調(diào)節(jié)著果酒的酸堿平衡，影響著果酒的口感及色澤[25]。對(duì)8株酵母菌發(fā)酵的冰梨酒中有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表6。由表6可知，8株菌所釀制的冰梨酒中有機(jī)酸總量比較接近。8株酵母菌發(fā)酵的冰梨酒中均含有10種有機(jī)酸，其中，除菌株DV10外，蘋果酸含量均為最高，約占總有機(jī)酸的30%左右，其次為乙酸、琥珀酸，這三種酸約占總有機(jī)酸的70%左右，是冰梨酒中的三種主要有機(jī)酸。菌株DV10產(chǎn)生的乙酸含量最高，達(dá)到了1.44 g/L，比菌株R2高7.46%；菌株KD10所釀制的冰梨酒中蘋果酸含量最高。乙酸含量低、蘋果酸含量高有利于冰梨酒感官品質(zhì)，因此，從產(chǎn)有機(jī)酸的角度考慮，釀制冰梨酒的適宜菌株為KD10、K1和71B。乙酸主要是由酵母代謝產(chǎn)生的，酒石酸、蘋果酸、檸檬酸則來自于梨果實(shí)。酵母既能代謝消耗有機(jī)酸，自身也能產(chǎn)生有機(jī)酸[16]。因此，造成不同酵母菌株發(fā)酵的冰梨酒中有機(jī)酸含量有較大差異。

2.2.3 冰梨酒的感官評(píng)價(jià)

對(duì)8株酵母菌發(fā)酵的冰梨酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表7。由表7可知，8株菌所釀制的冰梨酒澄清度沒有差異。在色澤上，由于菌株DV10和EC1118比其他菌株所發(fā)酵的冰梨酒色澤更深，呈深褐黃色，因而二者的感官評(píng)價(jià)得分稍低。8株菌所釀制的冰梨酒感官品質(zhì)存在一定差異，主要表現(xiàn)在香氣和口味上，其中菌株R2的得分最高。在風(fēng)格上，菌株R2和R-HST得分最高。從感官評(píng)價(jià)的總分看，菌株R2的感官評(píng)分最高。

表78 株酵母所釀的冰梨酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of ice pear wines brewed by eight yeast strains

根據(jù)上述的試驗(yàn)結(jié)果，從生長(zhǎng)能力、降糖及產(chǎn)酒精能力的角度考慮，菌株DV10的性能最優(yōu)，但該菌株所釀制的冰梨酒色澤差，香氣和口味也不夠好。菌株R2的綜合發(fā)酵性能僅次于DV10而明顯好于其他6株菌，且其感官質(zhì)量最優(yōu)。綜合考慮，確定釀酒酵母R2為釀制冰梨酒的適宜菌種。

3 結(jié)論

本研究以鴨梨為原料，接種釀酒酵母進(jìn)行低溫酒精發(fā)酵釀制冰梨酒。通過分析比較8株釀酒酵母的冰梨酒發(fā)酵性能，以及所釀制冰梨酒的理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量和感官品質(zhì)，最終確定釀酒酵母R2為釀制冰梨酒的適宜菌種。該酵母生長(zhǎng)繁殖快，降糖和產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，發(fā)酵性能優(yōu)良；釀出的冰梨酒酒香和諧，果香純正，口感甜美醇厚、柔和爽口，具有冰梨酒特有的風(fēng)味。與未發(fā)酵的冰梨汁相比，冰梨酒的總酸及揮發(fā)酸大幅度增加，且均符合GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為冰梨酒的研究與開發(fā)提供一定的參考。

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Screening ofSaccharomyces cerevisiaefor ice pear wine brewing

ZHAO Guoqun1,ZHANG Xiaoteng1,ZHAO Yifan1,GUAN Junfeng2*
(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China; 2.Institute of Genetics and Physiology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

The"Ya"pear,as the raw material,was squeezed and frozen concentrated into pear juice(ice pear juice),and then the concentrated juice was inoculatedSaccharomyces cerevisiaeand alcohol fermentation happened at low temperature(15℃).Through comparing the fermentation performances of eightS.cerevisiaeand the physicochemical indexes,organic acids contents and sensory quality of ice pear wine brewed by eight yeast strains,theS.cerevisiaeR2 was finally identified as the optimal yeast strain for ice pear wine brewing.The strain R2 had the characteristics of rapid growth,strong sugar-reducing and alcohol-producing capacity and excellent fermentation performances.The ice pear wine had sweet and full-bodied tastes with mellow and elegant fruit aroma,and showed typical flavor of ice pear wine.

ice pear wine;Saccharomyces cerevisiae;alcohol fermentation;screening

TS255.47

0254-5071（2017）06-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.016

2017-02-20

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)[梨]產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（cars-29）

趙國(guó)群（1963-），男，教授，博士，研究方向工業(yè)微生物技術(shù)。

*通訊作者：關(guān)軍鋒（1966-），男，研究員，博士，研究方向果品貯藏加工。