轉染NF-1基因對人增生性瘢痕成纖維細胞膠原表達的影響

鄭江紅 鄧辰亮 丁 志 茅廣宇 楊松林

轉染NF-1基因對人增生性瘢痕成纖維細胞膠原表達的影響

鄭江紅 鄧辰亮 丁 志 茅廣宇 楊松林

目的探討重組NF1基因轉染人增生性瘢痕成纖維細胞的可行性，以及轉染NF1基因對細胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響。方法體外重組NF1基因，借助真核表達載體系統(tǒng)，轉入體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細胞，通過激光共聚焦顯微鏡觀察報告基因表達，并確定細胞轉染效率。應用Real time PCR法比較轉染前后NF1 mRNA及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達；采用CCK-8比色法，比較轉染細胞與未轉染細胞增殖狀況。結果基因轉染后，約50%的被轉染細胞表達綠色熒光；NF1 mRNA在轉染組、轉染空載體組、未轉染組細胞中的表達分別為：7.27±1.16，2.01±0.38，1.87±0.29，轉染組NF1 mRNA相對表達量較未轉染組和轉染空載體組明顯增高（P＜0.01，n＝5）；Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在轉染組、轉染空載體組、未轉染組細胞中的表達分別為：3.01±0.48和2.05±0.25，0.89±0.18和0.94±0.16，0.99±0.11和0.92±0.19；轉染組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對表達量較未轉染組和轉染空載體組均明顯增高（P＜0.01，n＝5）。結論瘢痕成纖維細胞可作為NF1轉染的靶細胞，NF1基因可能是導致瘢痕異常增生的重要基因。

細胞核因子1轉染增生性瘢痕成纖維細胞

增生性瘢痕的病理表現為成纖維細胞過度增殖，炎性細胞浸潤以及長時間的膠原過量合成。細胞核因子1（Nuclear factor-1，NF1）作為細胞轉錄因子，在調控增生性瘢痕細胞外基質表達的過程中扮演著關鍵的角色[1-2]。有學者在研究中發(fā)現，增生性瘢痕組織中NF1的表達明顯高于正常真皮成纖維細胞[3]。為進一步研究NF1基因在增生性瘢痕細胞中的作用，本實驗擬通過轉染NF1基因進入人增生性瘢痕成纖維細胞，探討NF1轉染瘢痕成纖維細胞的可行性和轉染NF1基因對細胞增殖速率以及Ⅰ、Ⅲ型膠原合成造成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Top 10，高效真核表達載體pcDNA 3.0（Invitrogen公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司，美國)；胎牛血清(Hyclone公司，美國)；膠原酶NB 4(Serva公司，德國)；脂質體Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)；PCR引物由上海生物工程公司合成；TRIzol RNA抽提試劑盒(GibcoBRL)；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒、SYBPremix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)；GeneRulerTM1 kb DNA Ladder(Fermentas，立陶宛)；激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)；ABI 7300 Real time PCR擴增儀(ABI，美國)；GIS 22800型凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 NF1真核表達載體構建與鑒定

目的基因NF1 cDNA片段由RT-PCR方法獲取。PCR擴增引物Full length-F:5′AGCAGGCAGCAGAGTGTGG3′，Full length-R:5′TGGAAGGGAAAGCCGGAAC3′；PCR條件為：模板2 μL，PCR緩沖液5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，dNT 4 μL，H2O 36 μL。94℃(4 min)經94℃(30 s)68℃(2.5 min)35個循環(huán)后，68℃延伸10 min。產物長度為3 123 bp。PCR純化產物裝入克隆載體PMD 18-T，大腸桿菌Top 10在LB固體培養(yǎng)皿上涂片培養(yǎng)，經藍白斑篩選挑取單個白色菌落在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中擴增。用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切TA載體回收目的片段，表達載體pcDNA 3.0用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切回收線性載體，兩者用T4連接酶連接構建pcDNA-NF1，經酶切電泳鑒定。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組

增生性瘢痕標本來源于上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院門診患者。無菌條件下切取標本，以0.5%氯霉素沖洗標本并浸泡10 min，將標本剪碎至1～2 mm3大小，0.3%NB 4復合膠原酶，37°C搖床消化3 h，150目濾網收集過濾液，1 500 r/min離心10 min，收集細胞，按2×104cells/cm2接種于培養(yǎng)皿，24 h后首次換液。準備傳代，轉染。分組：未轉染正常組、轉染空載體pcDNA 3.0組和pcDNA 3.0-NF1轉染組。

1.2.3 細胞轉染

細胞轉染前24 h，按2×105個/孔的密度接種于6孔板中，細胞生長至30%～45%融合時轉染質粒。方法：取無血清DMEM培養(yǎng)液240 μL與10 μL Lipofectamine 2000混勻，另取240 μL DMEM培養(yǎng)液與10 μL（100 pmol）質?；靹?，5 min后分別合并脂質體和質粒兩液，室溫下放置20 min。吸掉培養(yǎng)液，以每孔1.5 mL添加純DMEM培養(yǎng)基，再加入脂質體質粒液，37℃培養(yǎng)5 h后，棄轉染液，換10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4 Real time PCR檢測

分別收集對數生長期的未轉染正常組細胞、轉染空載體pcDNA 3.0和NF1轉染組的細胞，用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計定量后，行逆轉錄反應（RT）：取總RNA 1 μg，oligo dT 1 μL（0.5 μg），補足DEPC處理的ddH2O至13 μL，65℃變性5 min，立即置冰浴，再加RNase抑制劑20 U，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，5倍逆轉錄酶緩沖液4 μL，M-MLV逆轉錄酶200 U 2μL，總體積20 μL。反應程序：25℃反應15 min，37℃反應1 h，95℃反應5 min，終止反應后，RT產物行Real time PCR法檢測NOS、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達。根據人NF1基因、Ⅰ、Ⅲ型膠原基因序列，設計上、下游引物序列為：NF1-F 5′TTCACAGACTGGCGTGGTCT 3′，NF1-R 5′GAGGT-GTACCCTGTCATGAT 3′；Collagen I-F 5′GAACGCG-TGTCATCCCTTGT 3′，Collagen I-R 5′GAACGAG-GTAGTCTTTCAGCAACA 3′；CollagenⅢ-F 5′AA-CACGCAAGGCTGTGAGACT 3′，CollagenⅢ-R 5′GCCAACGTCCACACCAAATT 3′。RT產物稀釋10倍后取1 μL作為模板，加入2倍SYBPremix Ex TaqTM12.5 μL，上游引物、下游引物(10 pmol)各1 μL，ddH2O補足體積到25 μL。反應條件：50℃2 min，95℃變性15 min后，95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。

1.2.5 細胞增殖檢測

以未轉染細胞為例，當細胞生長至70%融合時，收集、接種于96孔板中（2 000個/孔），加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內孵育3 h，酶標儀測A450吸光度，每組重復3次，繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 NF1基因克隆及表達載體構建

利用RT-PCR成功擴增了NF1基因全長，約3.1 kb(圖1)。載體在2%瓊脂糖凝膠中可見約8.5 kb DNA帶，與預期質粒大小結果相一致，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切電泳，在同一泳道中出現2條DNA帶，1條為5.4 kb，與空質粒DNA鏈長度一致，確定為質粒DNA帶；另1條約3.1 kb，與NF1 cDNA片段大小一致（圖1）?；驕y序后，證實所合成基因序列與基因庫中一致率為99.95%。

圖1 NF1克隆基因PCR產物及重組pcDNA 3.0-NF1質粒酶切電泳分析

2.2 瘢痕細胞NF1轉染綠色熒光蛋白報告基因的觀察

瘢痕細胞被轉染，在細胞漿內可見綠色熒光表達，瘢痕細胞被轉染48 h后，約50%細胞表達綠色熒光（圖2）。

圖2 綠色熒光蛋白報告基因的觀察示瘢痕細胞被轉染，在細胞內可見綠色熒光表達

圖3 NF1 mRNA在各實驗組細胞中的表達

2.3 Real time PCR檢測NF1 mRNA表達

轉染24 h后，Real time PCR檢測到NF1 mRNA在轉染組、轉染空載體組和未轉染組細胞中的表達分別為：7.27±0.93、2.01±0.22和1.87±0.21，轉染組NF1 mRNA相對表達量較未轉染組和轉染空載體組明顯增高（P＜0.01，n＝5）而未轉染組和轉染空載體組比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，n＝5，圖3）。

2.4 NF1轉染后對細胞增殖的影響

NF1基因轉染后，被轉染細胞的增殖與未轉染和轉染空載體細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4）。

2.5 NF1轉染后對細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響

Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在轉染組、轉染空載體組和未轉染組細胞中的表達分別為：3.01±0.37和2.05±0.28，0.89±0.17和0.94±0.18，0.99±0.14和0.92±0.16。轉染組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對表達量較未轉染組和轉染空載體組均明顯增高（P＜0.01，n＝5，圖5）。

圖4 CCK-8比色法測生長曲線

圖5 Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在各組細胞中的表達

3 討論

目前關于增生性瘢痕的病因及發(fā)病機制，尚未被完全闡明。已有研究發(fā)現，瘢痕組織中的膠原及細胞外基質（ECM）的代謝異常，是增生性瘢痕形成的重要原因之一，并且NF1在其中起重要作用[4-5]。NF1是保持組織特異性基因正確表達的一種重要轉錄因子，其特異結合啟動子區(qū)GC盒，激活增殖、凋亡、分化等有關基因轉錄[6－7]。在增生性瘢痕的局部組織中，NF1合成量增多，這提示NF1可能與瘢痕組織中ECM過量沉積有關[7]。因此，我們在研究中直接以瘢痕成纖維細胞為研究對象。為了進一步研究了解NF1在導致病理性瘢痕組織中細胞外基質增多中的作用，我們設計了先構建NF1基因再進行細胞轉染的研究方案，并采用廣泛應用的真核表達載體，該方法保證了研究結果的可靠性。

重組的NF1基因轉入體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細胞后，轉染的NF1轉錄因子是否在成纖維細胞中有效表達，是判斷NF1基因轉染成功與否的關鍵。我們采用激光共聚焦顯微鏡觀察和相對精確的Real time PCR方法相結合[8－9]，發(fā)現了部分瘢痕成纖維細胞表達綠色熒光報告基因，而且轉染后的細胞NF1 mRNA表達明顯高于對照細胞。這些結果提示，NF1基因已被成功轉入細胞內并且開始表達。本實驗結果表明，當細胞被導入NF1基因后，細胞內Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA合成增加。膠原是細胞外基質的主要成份，在增生性瘢痕組織的細胞外基質中，Ⅰ型膠原纖維占主要構成，由2條α1鏈和1條α2鏈按比例構成。Zhang等[10]在研究中發(fā)現，增生性瘢痕組織內Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA比正常組織表達增強，表達增強的部位主要存在于真皮淺層的纖維結節(jié)。通過我們的結果可以看出，轉染NF1基因后，增生性瘢痕成纖維細胞比未轉染的細胞表達瘢痕特征更加強烈，表明NF1表達增強可導致瘢痕成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達加強，進而提示我們，控制NF1的過度表達有可能控制瘢痕成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達，進而控制瘢痕組織中ECM過量沉積。

綜上所述，我們已經證實瘢痕成纖維細胞可作為NF1轉染的靶細胞。但是，通過抑制NF1基因來治療瘢痕異常增生的臨床應用，還有待進一步研究。

[1]Artlett CM,Chen SJ,Varga J,et al.Modulation of basal expression of the human alpha1(I)procollagen gene(COL1A1)by tandem NF-1/Sp1 promoter elements in normal human dermal fibroblasts [J].Matrix Biol,1998,17(6):425-434.

[2]Reid RR,Roy N,Mogford JE,et al.Reduction of hypertrophic scar via retroviral delivery of a dominant negative TGF-β receptor II[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2007,60(1):64-72.

[3]Wei D,Zhang L,Williams DL,et al.Glucan stimulates human dermal fibroblast collagen biosynthesis through a nuclear factor-1 dependent mechanism[J].Wound Repair Regen,2002,10(3):161-168.

[4]Uchihashi T,Kimata M,Tachikawa K,et al.Involvement of nuclear factor I transcription/replication factor in the early stage of chondrocytic differentiation[J].Bone,2007,41(6):1025-1035.

[5]Wu J,Ma B,Yi S,et al.Gene expression of early hypertrophic scar tissue screened by means of cDNA microarrays[J].J Trauma, 2004,57(6):1276-1286.

[6]Cutrone KR.How is type pro collagen synthesis regulated at the gene level during tissue fibrosis[J].Cell Biochem,2003,90(1):1-5.

[7]Christner PJ,Hitraya EG,Peters J,et al.Transcriptional activation of the alpha1(I)procollagen gene and up-regulation of alpha1(I) and alpha1(III)procollagen messenger RNA in dermal fibroblasts from tight skin 2 mice[J].Arthritis Rheum,1998,41(12):2132-2142.

[8]Lockey C,Otto E,Long Z.Real-time fluorescent detection of a single DNA molecule[J].Biotechniques,1998,24:744-746.

[9]Wang T,Brown MJ.mRNA quantification by real time TaqMan polymerase Chain reaction:validation and comparison with RNase protection[J].Anal Biochem,1999,269(1):198-201.

[10]Zhang K,Garner W,Cohen L,et al.Increased types I and III collagen and transforming growth factor-beta 1 mRNA and protein in hypertrophic burn scar[J].J Invest Dermatol,1995,104(5): 750-754.

Effects on Recombinant NF1 Gene on Collagen Expression of Hypertrophic Scar ifbroblasts In Vitro

ZHENG Jianghong,DENG Chenliang,DING Zhi,MAO Guangyu.YANG Songlin.
Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.Corresponding author:YANG Songlin.

ObjectiveTo explore the feasibility of transfecting recombinant NF1 into hypertrophic scar fibroblasts and investigate the proliferation and collagenⅠ,Ⅲsynthesis of transfected cells.MethodsRecombinant human NF1 gene was transfected into hypertrophic scar fibroblasts with the karyocyte expressive vector.The expression of NF1 gene,collagenⅠ,ⅢmRNA was quantified by real time PCR.The changes of cell proliferation were observed with CCK-8 colorimeter.Results Transfected hypertrophic scar fibroblasts showed positive green fluorescence nearly in 50%.The relative expression of NF1 mRNA in transfected cells,empty-vector cell and untransfected cells group are 7.27±1.16,2.01±0.38 and 1.87±0.29 respectively.Expression of NF1 mRNA increased significantly in transfected cells compared compared with either untransfected and empty-vector group(P＜0.01,n＝5).Expression of collagenⅠ,ⅢmRNA in transfected cells,empty-vector cell or untransfected cells group are 3.01±0.48,2.05±0.25;0.89±0.18,0.94±0.16;0.99±0.11,0.92±0.19 respectively, Expression of collagenⅠ,ⅢmRNA both increased significantly in transfected cells compared with either untransfected or empty-vector group(P＜0.01,n＝5).ConclusionThe hypertrophic scar fibroblasts seems to be the target cells of NF1 gene transfer.NF1 gene may be a critical factor,which caused abnormal collagen metabolism in hypertrophic scar.

Nuclear factor-1(NF1);Transfection;Hypertrphic scar;Fibroblast

Q753

A

1673－0364（2009）－01－0021－04

2008年11月19日；

2009年1月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.006

國家自然科學基金（30571929）；上海市衛(wèi)生局資助課題（2006055）。

200233上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

楊松林。