膠原-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸真皮支架材料修復(fù)兔角膜基質(zhì)缺損的研究

王偉紅 張 米 許小林 余春艷 金 巖

膠原-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸真皮支架材料修復(fù)兔角膜基質(zhì)缺損的研究

王偉紅 張 米 許小林 余春艷 金 巖

目的探討以角膜基質(zhì)細(xì)胞與膠原-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸（Collagen-chondroitin sulfate-hyaluronic acid，Co-CS-HA）真皮支架材料復(fù)合共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程化角膜基質(zhì)的可行性，為尋找理想的組織工程角膜支架提供依據(jù)。方法先行制備Co-CS-HA真皮支架材料，對其進(jìn)行掃描電鏡、孔隙率、體外降解性、力學(xué)性能和細(xì)胞增殖的檢測和分析。培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，將其與上述材料復(fù)合共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)，行兔角膜板層移植。術(shù)后大體觀察植片和新生血管狀況，并于術(shù)后第8周取材行組織學(xué)觀察。結(jié)果所制備的Co-CS-HA真皮支架材料為白色海綿狀結(jié)構(gòu)，其孔徑為(109±11)μm，孔隙均勻并有廣泛的交通孔，孔隙率為（94.75±0.39）%。體外降解性和力學(xué)性能檢測結(jié)果顯示材料的強(qiáng)度和抵抗酶解的能力顯著提高。MTS結(jié)果表明，材料對角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用。兔角膜板層移植后，組織工程角膜植片與宿主角膜組織相融性良好，能夠部分修復(fù)并填充角膜基質(zhì)缺損，但直到8周取材時(shí)仍留有大量的角膜新生血管。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)室制備的Co-CS-HA真皮支架材料符合支架材料的理化和生物學(xué)要求，可一定程度修復(fù)兔角膜基質(zhì)缺損，但在維持角膜的透光度方面仍存有缺陷，眼科應(yīng)用還需進(jìn)行更深入研究。

膠原硫酸軟骨素透明質(zhì)酸支架角膜基質(zhì)

角膜盲是臨床致盲的主要原因之一，角膜移植手術(shù)是治療角膜盲的主要手段，但是角膜供體嚴(yán)重缺乏，組織工程角膜的研究則為角膜盲的治療提供了一種新的可行的方法[1]，而合適的支架材料對于組織工程角膜的構(gòu)建具有重要意義。大量的實(shí)驗(yàn)證明，膠原基材料是體外支持細(xì)胞生長的良好生物載體，在皮膚、神經(jīng)、骨骼等器官的損傷修復(fù)中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[2-4]。鑒于膠原基材料良好的生物可降解性和生物相容性，本研究擬用本實(shí)驗(yàn)室新研制的膠原-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸(Collagen-chondroitin sulfate-hyaluronic acid，Co-CS-HA)真皮支架材料修復(fù)角膜基質(zhì)缺損，探討該材料的多種用途，也為其在眼科中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為組織工程角膜的研究與應(yīng)用創(chuàng)造條件。

1 材料和方法

1.1 材料

Ⅰ型膠原（本實(shí)驗(yàn)室用酸溶法從牛皮中提?。?；硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸（山東廣龍生物制品廠）；2-嗎啉乙烷磺酸［2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES］（Sigma公司)；琥珀酰胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（Sigma公司）；碳化二亞胺(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride，EDC) (Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季清公司)；MTS、膠原酶(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 支架材料的制備

Co-CS-HA真皮支架材料由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程中心實(shí)驗(yàn)室提供，其制備方法如下：Ⅰ型膠原溶于0.05 mol/L的冰醋酸溶液中（pH值2～3），4℃下攪拌制成1.25%（w/v）的Co溶液。分別用超純水溶解CS和HA，制成1.25%（w/v）的CS溶液和1.25%（w/v）的HA溶液。Co溶液調(diào)整pH值至中性，在4℃攪拌的條件下以9:1:1(v/v/v)的比例逐滴加入配好的CS和HA溶液，滴加的速度控制在0.5 mL/min。充分?jǐn)嚢韬?，將混合溶液倒?孔板內(nèi)輕輕震搖。平整后立刻置于-80℃冰箱冷凍3 h后，低壓冷凍干燥得Co-CS-HA海綿。將海綿材料稱重，按每50 mg浸泡于20 mL含50 mmol/L MES的40%乙醇溶液中30 min（室溫）。然后按每50 mg干重，分別浸泡在20 mL含50 mmol/L MES、5 mmol/L EDC、5 mmol/L NHS的40%乙醇溶液中室溫下交聯(lián)24 h，將支架在0.1 mol/L Na2HPO4中清洗2次，共1 h；1 mol/L NaCl中清洗2次,共2 h；2 mol/L NaCl中清洗24 h，用超純水清洗10次,-80℃冰箱冷凍3 h后，低壓冷凍干燥得到Co-CS-HA真皮支架材料。60Co消毒備用。

1.2.2 兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將新西蘭大白兔（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）于手術(shù)顯微鏡下，解剖分離角膜。磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗后，撕去內(nèi)皮面及上皮面，剩余部分剪碎，加入625 U/mL的膠原酶4℃下消化16 h，吹打、過篩、離心、棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。次日換液，以后每隔3天換液一次。

1.2.3 支架材料的掃描電鏡觀察

取材料0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小，經(jīng)表面鍍金后，用HITACHIS-3400N（Japan）掃描電鏡(Scanning electron microscopy，SEM)觀察材料的孔性結(jié)構(gòu)及支架的空間排列，并根據(jù)放大倍數(shù)，計(jì)算樣品的平均孔徑。

1.2.4 支架材料孔隙率的測定

將材料制備成1 cm×1 cm×0.2 cm的長方體樣本，采用體積法測定，計(jì)算平均表觀體積V1，將其浸入盛有體積為V2的乙醇量筒中，反復(fù)抽真空，直至支架材料不再冒氣泡為止，此時(shí)量筒讀數(shù)V3，按下列公式計(jì)算孔隙率。

1.2.5 支架材料的體外降解率測定

材料用環(huán)鉆制備成直徑為0.8 cm，厚為0.2 cm的圓柱形樣本，干燥稱重后得W1，將每塊材料浸入25 U/mL濃度的Ⅰ型膠原酶中酶解5 h后取出樣本，PBS液沖洗3次，低壓冷凍干燥稱重得W2，按下列公式計(jì)算降解率，與單純膠原海綿材料作對比分析。

1.2.6 支架材料的力學(xué)性能檢測

將材料制備成1 cm×2 cm×0.2 cm的樣本，用拉力試驗(yàn)機(jī)(EZ-Test，SHIMADZU 500N，Japan)進(jìn)行拉伸強(qiáng)度測試，夾具間距為15 mm，拉伸速度為2 mm/min，結(jié)果與單純膠原海綿材料作對比分析。

1.2.7 MTS檢測支架對兔角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

材料以環(huán)鉆制備成直徑為0.6 cm、厚為0.2 cm的圓柱形測試樣本，60Co消毒后移入96孔板。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞稀釋配成單細(xì)胞懸液，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，置含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。分別在第1、3、5、7 d取出一個(gè)孔板，棄去原培養(yǎng)液，每孔中加入100 μL無血清培養(yǎng)液和20 μL MTS，繼續(xù)在37℃的孵箱中培養(yǎng)2 h，移出樣本，選擇490 nm波長，測定各孔OD值。與單純膠原海綿材料作對比分析。

1.2.8 組織工程角膜基質(zhì)的構(gòu)建

60Co消毒后的Co-CS-HA真皮支架材料放入一次性孔板中，用與培養(yǎng)角膜基質(zhì)細(xì)胞相同的培養(yǎng)液浸泡24 h，取出放入另一孔板中24 h稍晾干。將擴(kuò)增后的第3代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞按2.5×104cells/cm2滴加到支架材料上[5]，3 h后待細(xì)胞完全吸附在材料上再加入培養(yǎng)液，置于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天換液。1周后，組織工程角膜即可用于移植。

1.2.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

新西蘭大白兔耳緣靜脈注射速眠新和氯胺酮，麻醉平穩(wěn)后，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，常規(guī)消毒鋪巾，開瞼器開瞼，1號縫線懸吊上下直肌，手術(shù)顯微鏡下，由11～13點(diǎn)鐘位，掀起角膜基質(zhì)瓣，其深度約達(dá)角膜全層的1/3，鈍性分離基質(zhì)囊袋，植入先行制備的組織工程角膜基質(zhì)，基質(zhì)瓣復(fù)位，10-0眼科纖維線縫合切口。術(shù)畢結(jié)膜下注射慶大霉素20 000 U，地塞米松2 mg，紅霉素眼藥膏涂眼。每日觀察角膜透明度及新生血管，并于第8周取材，行HE染色組織病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 支架材料的物理性狀

所制備的Co-CS-HA真皮支架材料為白色海綿狀結(jié)構(gòu)。SEM觀察，材料為廣泛溝通的多孔結(jié)構(gòu)，其孔隙均勻，平均孔徑大小為（109±11）μm(圖1)，孔隙率為（94.75±0.39）%。Co-CS-HA材料對5 h、25 U/mLⅠ型膠原酶的降解率為（23.48±4.84）%，而單純膠原海綿的降解率為（89.80±2.41）%。兩者比較，Co-CS-HA材料抵抗酶解能力顯著提高(P＜0.05) (圖2-A)。強(qiáng)度測試，Co-CS-HA的極限抗張強(qiáng)度（Ultimate tensile strength，UTS）為（285±19）KPa，而單純膠原海綿的UTS僅為(24±9)KPa。兩者比較，Co-CS-HA材料的力學(xué)性能顯著提高(P＜0.05)(圖2-B)。

2.2 兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)

兔角膜基質(zhì)細(xì)胞消化后1～2 h貼壁，細(xì)胞伸展呈梭形或紡錘形，胞漿清亮，核居中。2～3 d，細(xì)胞形成密集單層，排列非常整齊，呈漩渦狀，生長狀態(tài)良好(圖3)。

2.3 MTS結(jié)果

兔角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于Co-CS-HA和單純膠原海綿材料上，培養(yǎng)7 d，分別于第1、3、5、7天測OD值。結(jié)果顯示，第1天兩者無明顯區(qū)別(P＞0.05)；第3～7天兩者曲線都有上升趨勢，但Co-CS-HA材料的OD值明顯高于單純膠原海綿材料(P＜0.05)(圖4)。實(shí)驗(yàn)表明，兩種材料對細(xì)胞均無明顯毒性，但Co-CS-HA材料促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的作用更加明顯。

2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

囊袋移植術(shù)后，植片呈瓷白色(圖5)。1周后，可見組織工程角膜植片在位，色灰白，植床角膜水腫充血，角膜緣新生血管長入；術(shù)后4周，水腫開始消退，角膜透明度較術(shù)后即刻稍透明；至6周，水腫消失，植片局部開始變薄，但仍有大量的新生血管浸潤；至第8周處死動(dòng)物時(shí)仍無改變(圖6)。術(shù)后8周，組織病理學(xué)觀察可見組織工程角膜植片部分降解，其余與角膜基質(zhì)組織融合生長。角膜基質(zhì)細(xì)胞均勻的分布在植片中，排列成層狀，分泌大量基質(zhì)。植片中還可見少量的炎性細(xì)胞和血管樣結(jié)構(gòu)(圖7)。

圖1 Co－CS－HA真皮支架材料掃描電鏡結(jié)果

圖2 Co－CS－HA材料和單純膠原材料體外降解性和強(qiáng)度的比較（＊:P＜0.05,有顯著性差異）

圖3 相差顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)細(xì)胞(P3，40×)

圖4 Co－CS－HA材料和單純膠原材料MTS結(jié)果的比較(＊：P＜0.05，有顯著性差異)

圖5 組織工程角膜基質(zhì)板層移植

圖6 板層移植后8周

圖78 周后取材結(jié)果(HE，200×)

3 討論

角膜是眼球的第一道屏障，對視覺形成極其重要。角膜移植是目前治療嚴(yán)重角膜疾病的主要方法，但角膜供體缺乏、術(shù)后并發(fā)癥限制了它的臨床應(yīng)用，組織工程技術(shù)的興起和發(fā)展則為其開辟了嶄新的治療前景[6]。組織工程學(xué)的研究主要包括以下三方面的內(nèi)容：細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增的研究、支架材料的研究和組織工程化組織在各種病損組織中替代的研究，而支架材料在組織構(gòu)建中占有重要地位[7]。目前，用于構(gòu)建組織工程角膜的支架材料主要有人工合成材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等，其物理性狀較好，但降解產(chǎn)物大量產(chǎn)酸，可導(dǎo)致局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，不適于臨床應(yīng)用[8]；天然材料，如膠原海綿，其生物相容性好，有較多的孔隙可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，但強(qiáng)度和抵抗酶解的能力差，無法修復(fù)缺損[2]。羊膜被認(rèn)為是工程化角膜的最佳生物支架材料[9]，但羊膜相對較薄，僅適用于治療眼表損傷，對于深達(dá)角膜基質(zhì)的缺損療效不佳?；|(zhì)層是構(gòu)成角膜的主要部分，占角膜厚度的90%以上，主要由排列整齊的膠原纖維、角膜基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。本實(shí)驗(yàn)室所制備的Co-CS-HA真皮支架材料在修復(fù)真皮缺損方面已取得較好的結(jié)果，考慮到真皮的功能和成份與角膜基質(zhì)有相似之處，本實(shí)驗(yàn)將其用于修復(fù)角膜基質(zhì)缺損，以期找到一種較為理想的角膜基質(zhì)支架材料。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察檢測，Co-CS-HA材料的平均孔徑為（109±11）μm，孔徑大小合適，孔隙均勻并有廣泛的交通孔，孔隙率高達(dá)90%以上。在生物性狀方面，不僅克服了單純膠原海綿強(qiáng)度差和降解太快的缺點(diǎn)，而且MTS結(jié)果表明其還有明顯的促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的作用。以上結(jié)果提示我們，用Co-CS-HA真皮支架材料體外構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)是可行的。

生物相容性是驗(yàn)證組織工程角膜能否應(yīng)用于臨床的先決條件。因此，我們將角膜基質(zhì)細(xì)胞和Co-CS-HA支架復(fù)合構(gòu)建的組織工程角膜基質(zhì)移植入兔的角膜基質(zhì)囊袋中。研究發(fā)現(xiàn)，此組織工程角膜基質(zhì)可以長期存留，并能夠部分修復(fù)并填充角膜基質(zhì)缺損，但直到第8周，仍留有大量的角膜新生血管，從而影響角膜透明度（正常角膜處于無血管狀態(tài)以維持角膜的透明度）。雖然新生血管對感染清除、傷口愈合、抑制角膜溶解等有一定作用[10]，但它也可破壞角膜正常微環(huán)境，使眼前節(jié)相關(guān)免疫赦免偏離消失[11]，是角膜移植排斥反應(yīng)的高危因素，而且大量的新生血管可使角膜失去透明性。

我們期望真皮中能有新生血管的長入，以維持皮膚的正常功能。但對于角膜，我們卻不希望大量新生血管的長入，以影響其透明性。綜上所述，Co-CS-HA真皮支架材料雖然具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，較好的生物降解性、機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞相容性，具有良好的細(xì)胞生長界面，能夠作為“橋梁”誘導(dǎo)周圍的正常角膜上皮細(xì)胞移行到缺損區(qū)域生長以達(dá)到修復(fù)組織的目的，但在維持角膜的透光度方面仍存有缺陷，眼科應(yīng)用還有待于進(jìn)一步的研究。

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Fabrication of Collagen-Chondroitin Sulfate-Hyaluronic Acid Scaffold and Its Biological Characteristics forCornear Stroma Tissue Engineering

WANG Weihong1,ZHANG Mi2,XU Xiaolin2,YU Chunyan1,JIN Yan2.
1 Department of Dermatology,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,China;2 Research and Development Center for Tissue Engineering,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China. Corresponding author:JIN Yan.

ObjectiveTo develop a scaffold material containing collagen-chondroitin sulfate-hyaluronic acid(Co-CSHA)and corneal stromal cells corneal stroma tissue engineering.MethodsFabricated scaffold of Co-CS-HA for dermal tissue engineering and to evaluated its characteristics in vitro.The tissue-engineered corneal stroma was constructed by co-culturing rabbit keratocytes on Co-CS-HA scaffold.It was then transplanted into corneal stroma of rabbit.This tissue-engineered corneal stroma was observed and harvested after 8 weeks for gross and histological evaluation.ResultsThe scaffold of Co-CS-HA was white sponginess structure and had uniform,and widely inter-connected pores with mean diameters of(109±11)μm and adequate porosity of about 94%.Mechanical properties and biodegradation rates assessment indicated that it was also more degradation-resistant and had higher elastic modulus than collagen sponge.The porous scaffold has a good biocompatibility for the attachment and proliferation of the cornear stroma cells without cytotoxicity.After implanted into corneal stroma of rabbit,the corneal stroma equivalent could partially repair defect.But there had been a plenty of corneal new vessels remained until 8 weeks.ConclusionThe scaffold of Co-CS-HA for dermal tissue engineering can repair corneal stroma defect to some extent,but there were still many new vessels left.So it should be studied deeply in clinical application of ophthalmology.

Collagen;Chondroitin sulfate;Hyaluronic acid;Scaffold;Corneal stroma

Q813.1+2,R779.65

A

1673－0364（2009）－01－0012－04

2008年12月19日；

2009年1月16日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.004

國家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA02A119)。

710032陜西省西安市第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科(王偉紅，余春艷)；第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程中心(張米，許小林，金巖)。

金巖。