農(nóng)藥克百威單鏈抗體基因構(gòu)建及蛋白結(jié)構(gòu)模擬

劉細(xì)霞 楊金易，2 王弘 龐杰 雷紅濤 沈玉棟 孫遠(yuǎn)明

（1.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州，510640；2.中科院華南植物園；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品學(xué)院）

農(nóng)藥克百威單鏈抗體基因構(gòu)建及蛋白結(jié)構(gòu)模擬

劉細(xì)霞1楊金易1，2王弘1龐杰3雷紅濤1沈玉棟1孫遠(yuǎn)明1

（1.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州，510640；2.中科院華南植物園；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品學(xué)院）

構(gòu)建小分子農(nóng)藥克百威（CBF）單鏈抗體（scFv）基因，進(jìn)行蛋白質(zhì)二級、三級預(yù)測并對其理化特性進(jìn)行分析。采用重疊延伸PCR方法，以能特異性分泌抗CBF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5D3為原料，構(gòu)建抗CBF scFv基因，進(jìn)行測序，采用生物信息軟件對氨基酸序列推導(dǎo)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，同時對理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果得出，抗CBF scFv基因全長750 bp，對應(yīng)228個氨基酸，單鏈抗體分子量約為26315.1，等電點預(yù)測值5.66，為酸性蛋白質(zhì)；二級結(jié)構(gòu)顯示抗克倫特羅單鏈抗體含α螺旋18處，β折疊108處，β轉(zhuǎn)角24處，隨機(jī)卷曲93處。三級結(jié)構(gòu)建模顯示VL和VH符合scFv的結(jié)構(gòu)特點，可觀察到6個環(huán)區(qū)形成疏水的“口袋”，具有抗原結(jié)合位點的空間構(gòu)象。從而構(gòu)建了一個抗CBF scFv基因，應(yīng)用信息學(xué)技術(shù)所獲得的預(yù)測和分析結(jié)果為抗克倫特羅單鏈抗體的進(jìn)一步表達(dá)、純化和活性研究提供了大量的信息。

克百威 單鏈抗體 結(jié)構(gòu)預(yù)測

克百威 （carbofuran，CBF，化學(xué)名2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯），商品名呋喃丹，是一種高效、廣譜的氨基甲酸酯類殺蟲劑，但因其對人和動物具有很高的毒性，并且不易降解，容易造成環(huán)境污染，國家農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)中已規(guī)定其在糧食和蔬菜中不得檢出，但違禁使用現(xiàn)象仍較嚴(yán)重。免疫分析法具有靈敏、簡便、快速等特點，在食品安全監(jiān)測中具有突出的優(yōu)勢，其中高質(zhì)量的抗體制備是關(guān)鍵[1～2]。

基因工程抗體為小分子農(nóng)藥快速低成本制備目的抗體提供了一條新的途徑[3～6]。現(xiàn)有的研究表明，重組單鏈抗體（single chain Fv，scFv）能夠保留與親本單克隆抗體（MAb）結(jié)構(gòu)相一致的抗原識別位點[7～12]。因此，構(gòu)建目標(biāo)抗體基因，對基因序列進(jìn)行分析，并推導(dǎo)預(yù)測抗體的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)對于重組抗體的進(jìn)一步表達(dá)和在免疫檢測中的應(yīng)用具有重要意義。

本研究以CBF為對象，通過分泌高特異性抗CBL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5D3，直接構(gòu)建其scFv基因在此基礎(chǔ)上對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，為該基因進(jìn)一步原核和真核系統(tǒng)的表達(dá)以及抗體的分子修飾改造提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗CBF單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株5D3由廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室自建。pCANTAB5E vector購自美國大腸桿菌E.coli TG1，Trizol試劑購自Invitrogen公司；載體pCANTAB5E，輔助噬菌體M13KO7購自美國Amersham Biosciences公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Promega公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海申能博彩公司；DEPC，dNTP購自廣州威佳生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。Linker全長及引物由北京賽百盛公司合成。

1.2 試驗方法

①總RNA提取 取1×106左右的對數(shù)生長期的抗CBF雜交瘤細(xì)胞5D3，加入1.5 mL TRIzol裂解液，徹底勻漿，室溫放5 min，加300 μL氯仿，均勻振蕩，室溫放5 min，4℃，12000 r/min離心15 min，75%乙醇1 mL洗滌沉淀，4℃，5000 r/min離心5 min，去上清液，干燥沉淀，用DEPC處理的ddH2O溶解，70℃保存。

表1 各引物序列表

b.VL基因片段的擴(kuò)增。取cDNA第一鏈反應(yīng)物2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol/L）4 μL，VH（Back）引物（10 μmol/L）1 μL，VH（For）引物（10 μmol/L）1 μL，無菌純水37～50 μL，渦旋混勻，短暫離心后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃變性5 min，加入0.5 μL高保真Taq酶后，94℃，30 s；54℃，1 min；72℃，1 min；25個循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及凝膠回收純化，取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

c.VH基因片段的擴(kuò)增。以VL（Back）（10 μmol/L）1 μL，VL（For）（10 μmol/L）1 μL為引物，PCR反應(yīng)體系同上。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃變性5 min，加入0.5 μL高保真Taq酶后，94℃，30 s；60℃，1 min；72℃，1 min；30個循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及凝膠回收純化，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

圖1 VH、VL及scFv PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組克隆PCR擴(kuò)增鑒定

d.scFv拼接及擴(kuò)增。重疊延伸法將VH和VL用Linker拼接起來。首先進(jìn)行l(wèi)inker的預(yù)拼接：Linker1引物 （10 μmol/L）0.5 μL，Linker2引物（10 μmol/L）0.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，去離子水34.5 μL，反應(yīng)溶液渦旋混勻，短暫離心。94℃預(yù)變性5 min，加入0.5 μL高保真Pfu酶，94℃，45 s；50℃，1 min；72℃，1 min；3個循環(huán)。在上面體系中補(bǔ)加VH 3 μL，VL 2.5 μL后，用槍輕輕混勻，94℃預(yù)變性5 min，補(bǔ)加0.5 μL高保真Pfu酶，94℃，45 s；50℃，1 min；72℃，1 min；30個循環(huán)，72℃延伸10 min。取4 μL拼接產(chǎn)物，加入10 μL 5×PCR Buffer，4 μL dNTP（2.5 mmol/L），RS（Back）、RS（For）各1 μL，無菌水30 μL，混合均勻，短暫離心后，94℃預(yù)變性2 min，加入0.5 μL高保真 Pfu酶，94℃，45 s；60℃，1 min；72℃，1 min；30個循環(huán)，72℃延伸10 min。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

圖3 抗CBF單鏈抗體基因全序列

圖4 VH、VL推導(dǎo)氨基酸序列

③scFv基因與克隆載體的連接和擴(kuò)增 將5D3 scFv基因插入到pCANTAB5E載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TG1，挑選克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并將克隆進(jìn)行測序。擴(kuò)增引物為R1，R2。

④抗CBF scFv結(jié)構(gòu)分析 a.基因片段測序及氨基酸序列推導(dǎo)及比對。挑取經(jīng)鑒定的重組克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提并送交Invitrogen公司測序。根據(jù)起始密碼子“ATG”的位置，采用軟件WinGene3進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)。同時，根據(jù)Kabat法則，對抗體可變區(qū)VH、VL的FR區(qū)及CDR區(qū)進(jìn)行劃分。將推導(dǎo)的氨基酸序列。

b.編碼蛋白的理化性質(zhì)分析。根據(jù)推導(dǎo)抗CBF單鏈抗體氨基酸全序列，采用ExPASy Proteomics tools在線工具中的ProtParam子程序?qū)贵w蛋白的氨基酸組成、分子量、等電點等物理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行理論計算。

c.編碼蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。根據(jù)推導(dǎo)抗CBF單鏈抗體氨基酸全序列，采用ExPASy Proteomics tools在線工具中的SOPMA子程序?qū)贵w蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，采用在線工具中的CPHmodels子程序?qū)贵w分子的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體V區(qū)基因PCR擴(kuò)增及鑒定

由圖1可見，采用設(shè)計的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，分別獲得VH，VL片段，大小分別約為350 bp和320 bp。經(jīng)重疊延伸法拼接、PCR擴(kuò)增后，scFv的PCR產(chǎn)物約擴(kuò)增出760 bp條帶，與預(yù)期值相符。采用R1、R2引物對重組子進(jìn)行PCR鑒定。R1、R2引物為載體上在多克隆位點兩端所設(shè)計的引物。如果插入了長度為760 bp的scFv片段，則可以擴(kuò)增出約1 Kb的DNA片段。隨機(jī)挑取了8個克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，如圖2所示，其中4個含插入片段的約1 Kb條帶。

2.2 抗CBF scFv結(jié)構(gòu)分析

①scFv序列測定 抗CBF scFv序列全長為729個堿基（圖3），其中VH長度為363個堿基，連接肽長度為45個堿基，VL長度為321個堿基。

②抗CBF scFv氨基酸序列推導(dǎo) 采用軟件WinGene3進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列以及FR區(qū)、CDR區(qū)的劃分如圖4所示。重鏈VH含121個氨基酸，輕鏈VL含107個氨基酸。從在CDR區(qū)發(fā)生變異的氨基酸分布看，變異氨基酸主要出現(xiàn)在VH的CDR2、CDR3區(qū)及VL的CDR1、CDR3區(qū)，提示這4個區(qū)的氨基酸組成可能與抗體識別CBF抗原密切相關(guān)。Abigail V Y C等[12]在對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中大量的抗體序列分析后也表明，VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR3四個區(qū)域的氨基酸組成主要影響抗體抗原結(jié)合位點的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

③抗CBF scFv結(jié)構(gòu)及特性分析 根據(jù)軟件預(yù)測分析，抗CBF單鏈抗體的二級結(jié)構(gòu)含α螺旋18處，β折疊108處，β轉(zhuǎn)角24處，隨機(jī)卷曲93處?？笴BF單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)模擬圖如圖5所示?？梢姡S模擬圖符合典型scFv的結(jié)構(gòu)，可觀察到抗體可變區(qū)的6個環(huán)區(qū)（CDR區(qū)），共同組成抗體的抗原結(jié)合區(qū)。

另外，對抗CBF單鏈抗體理化性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果表明，該抗體分子量為26315.1，分子式為C1163H1762N308O373S9，等電點為5.66，酸性氨基酸殘基為23個 （Asp+Glu），堿性氨基酸殘基為22個（Arg+Lys），為酸性蛋白。因此如果采用離子交換法對此scFv進(jìn)行純化，可采用陰離子交換柱對此蛋白進(jìn)行吸附純化，也可采用陽離子交換柱對雜蛋白進(jìn)行吸附來純化。而采用凝膠過濾的方法進(jìn)行純化時則注意在26 kD的出峰時間處進(jìn)行收集。

3 結(jié)論

本研究從抗克百威雜交瘤細(xì)胞中獲得了抗CBF scFv基因，經(jīng)測序，基因全長729 bp，其中重鏈VH為363 bp，輕鏈VL為321 bp，連接肽為45 bp。通過氨基酸序列推導(dǎo)，抗CBF單鏈抗體蛋白由228個氨基酸組成，抗體分子量約為26315.1，等電點預(yù)測值5.66，為酸性蛋白質(zhì)，這些預(yù)測結(jié)果為抗克百威單鏈抗體基因表達(dá)、蛋白純化和活性研究等后續(xù)實驗提供了信息；并為抗體進(jìn)一步改建、研究抗原抗體反應(yīng)機(jī)制提供了一定的依據(jù)。

圖5 抗CBF單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)模擬圖

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Construction and Structure Prediction of Murine Single Chain Fv Gene against Carbofuran

LIU Xixia1,YANG Jinyi1,2,WANG Hong1,PANG Jie2,LEI Hongtao1,SHEN Yudong1,SUN Yuanming1

The gene of single chain Fv fragment(scFv)was constructed against carbofuran and the physical and chemical characteristics,secondary structure and tertiary structure of the scFv was predicted using computer assisted modeling.The variable region gene of the heavy and light chains were amplified respectively from 5D1 hybridoma cells that can secret monoclonal antibodies with high activity and specificity against carbofuran.These two fragments were then spliced together through a flexible linker to scFv by using splicing overlap extension(SOE)PCR.The scFv gene was named cbf and the sequence of scFv gene was measured.The physical and chemical characteristics,secondary and tertiary structure were predicted using Internet and corresponding software.The whole scFv gene contained 750 bp was cloned successfully and encoded 228 amino acids.Theoretically,the scFv was relative molecular masses 26315.1,the isoelectric point(pI)was 5.66 and the antibody belongs to acid protein.The predictied secondary structure showed the protein contained 18 α-helix,108 β-sheet,24 β-turn and 93 random coli.The mimic tertiary structure model of scFv indicted the linker was isolated from VH and VL.The VL,as well as the VH,was involved in composing the hydrophobic"pocket"which was beneficial to the antigen binding.The construction and analysis of scFv against carbofuran laid the foundation for the further research into expression,purification and bioactivity of the genetic engineering antibody.

Carbofuran;Single chain Fv(scFv);Structure prediction

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.16.027

國家自然科學(xué)基金（30871755，30400354），廣東省自然科學(xué)基金（06025825），福建省科技重點項目（2008Y0006）

劉細(xì)霞，女，博士研究生，研究方向為食品質(zhì)量安全，電話：020-85283448。E-mail:gzwhongd@163.com

王弘，通信作者

2009-08-03