嫁接對NaCl脅迫下西瓜葉片抗氧化物酶活性及其同工酶的影響

劉香娥 郭世榮 田婧 段九菊 杜長霞

（南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，農(nóng)業(yè)部南方蔬菜遺傳改良重點開放實驗室，江蘇南京，210095）

嫁接對NaCl脅迫下西瓜葉片抗氧化物酶活性及其同工酶的影響

劉香娥 郭世榮 田婧 段九菊 杜長霞

（南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，農(nóng)業(yè)部南方蔬菜遺傳改良重點開放實驗室，江蘇南京，210095）

以耐鹽性較強的葫蘆品種“超豐抗生王”為砧木，以鹽敏感型的西瓜品種“秀麗”為接穗，研究了嫁接對鹽脅迫下西瓜植株葉片SOD，POD，APX酶活性及其同工酶的影響。研究結(jié)果表明，鹽脅迫8 d后，嫁接苗株高、莖粗、鮮質(zhì)量等生長指標受抑制程度均顯著低于自根苗，嫁接苗和自根苗SOD，POD，APX活性均降低，但嫁接苗降低程度顯著低于自根苗；正常營養(yǎng)液培養(yǎng)8 d后，嫁接植株葉片POD，APX同工酶產(chǎn)生特異條帶；鹽脅迫8 d后，嫁接苗和自根苗SOD，POD，APX酶譜強度均減弱，但嫁接苗酶譜減弱程度較低?？梢?，嫁接可調(diào)節(jié)西瓜植株抗氧化物酶活性及其同工酶基因的表達，緩解鹽脅迫對西瓜植株的傷害。

嫁接 NaCl脅迫 小型西瓜 酶活性 同工酶

西瓜為葫蘆科一年生草本植物，隨著西瓜設(shè)施栽培面積的不斷擴大和連年種植，由土傳病害引起的連作障礙日益嚴重，尤其是西瓜重茬田間枯萎病大面積發(fā)生，已成為西瓜高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要障礙因子。雖然輪作是防治枯萎病的有效措施，但由于土地面積的限制和專業(yè)化生產(chǎn)的需要，合理輪作往往難以實現(xiàn)，加之藥劑防治效果差且不利于環(huán)境保護，培育抗病品種周期長和種質(zhì)資源等限制，因此，采用嫁接技術(shù)已成為生產(chǎn)上克服連作障礙和防治病害的一項行之有效的方法[1～2]。目前在西瓜嫁接砧木的篩選與利用方面僅限于種內(nèi)或瓠子和南瓜等少數(shù)瓜類植物，研究內(nèi)容限于抗性、嫁接技術(shù)、營養(yǎng)生理、產(chǎn)量和品質(zhì)效應(yīng)[1～4]等方面，有關(guān)嫁接西瓜植株體內(nèi)與抗逆性相關(guān)的抗氧化物酶及其相應(yīng)同工酶的報道較少。本文以篩選出的耐鹽性較強的葫蘆品種為砧木，以鹽敏感型的小型西瓜品種為接穗，研究了嫁接對NaCl脅迫下西瓜幼苗葉片抗氧化物酶活性及其同工酶的變化，旨在進一步探討嫁接提高西瓜植株耐鹽性的內(nèi)在原因，為西瓜嫁接抗逆栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的西瓜（Citrullus lanatusM.）接穗品種為鹽敏感型的小果型品種秀麗（由安徽省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所提供），砧木為耐鹽型的葫蘆（Lagenaria siceraria Standl）品種超豐抗生王[6]（由中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所西甜瓜研究所提供）。

1.2 試驗方法

①試材培育 試驗于2008年5月在南京農(nóng)業(yè)大學玻璃溫室內(nèi)進行，選取飽滿、整齊一致的葫蘆砧木種子，溫湯浸種15 min后，用自來水浸泡10 h，29±1℃培養(yǎng)箱催芽，露芽后播于裝有石英砂的直徑12 cm、高12 cm的硬質(zhì)塑料營養(yǎng)缽中，晝溫25～30℃，夜溫15～18℃。子葉露出時，播種西瓜接穗。待砧木第1片真葉展開、接穗2片子葉展平時，采用插接法進行嫁接。嫁接苗的培育按照曾義安等[7]的方法進行。

②試驗處理 嫁接苗3葉1心時，選生長整齊一致的植株定植于裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液的栽培槽中，用氣泵間歇（40 min/h）式對營養(yǎng)液通氣，每5 d更換1次營養(yǎng)液，緩苗5 d后開始處理。試驗設(shè)4個處理：a.正常營養(yǎng)液栽培自根苗（CK1），b.含50 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液栽培自根苗（CK1＋NaCl），c.正常營養(yǎng)液栽培嫁接苗（CK2），d.含50 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液栽培嫁接苗 （CK2＋NaCl）。含 50 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液是在營養(yǎng)液中添加分析純NaCl，使營養(yǎng)液中Na＋終濃度為50 mmol/L。每處理36株，試驗重復3次。

③測定項目及方法 于處理8 d時，取自上向下第3片完全展開功能葉測定各項生理指標，重復測定 5次，每區(qū)每次取樣 3株。采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[8]，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[9]，抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性按照Nakano等[10]的方法測定。

保護酶的同工酶用50 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液（含0.15 mmol/L EDTA，0.3%Triton-x-100T，4%PvPP）提取，冰浴研磨，4℃12 000 r/min，20 min，上清液作同工酶分析用。采用PAGE垂直電泳，電極緩沖液用Tris-Gly緩沖液（pH值8.3）。

SOD分離膠濃度T＝7.5%，濃縮膠濃度T＝2.5%，采用氮藍四唑法（NBT）染色[11～12]；POD分離膠濃度T＝7.5%，濃縮膠濃度T＝3.1%，染色采用改良式聯(lián)苯胺法[12]；APX分離膠濃度T＝8%，濃縮膠濃度T＝4%，染色步驟參照Mittler[13]的方法。

酶帶的相對遷移率（Rf）[14]：Rf＝樣品帶遷移的相對距離/溴酚藍遷移相對距離。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用DPS軟件進行單因素方差分析，并對平均數(shù)用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

圖1 嫁接對NaCl脅迫下西瓜植株葉片SOD，POD，APX活性的影響

表1 嫁接對NaCl脅迫下西瓜幼苗生長的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜自根苗和嫁接苗的生長

表1表明，非鹽脅迫條件下，嫁接苗植株株高、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量比自根苗分別提高了164.9%，108.9%，165.7%，70.0%，因此嫁接可顯著促進西瓜植株的生長。NaCl脅迫后，自根苗的株高、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別比對照降低了73.1%，45.8%，65.8%，45.6%，差異均達顯著水平；而嫁接苗的株高、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別比對照降低了22.5%，6.44%，28.8%，17.7%，僅株高和鮮質(zhì)量顯著低于嫁接苗對照，其他生長指標差異均不顯著。表明NaCl脅迫下，自根苗生長受到嚴重抑制，而嫁接苗生長受抑制程度較小，因此，嫁接可顯著緩解NaCl脅迫對西瓜幼苗植株生長的傷害，提高植株的抗鹽性。

2.2 西瓜自根苗和嫁接苗葉片保護酶活性

由圖1可知，非鹽脅迫條件下，嫁接苗SOD活性比自根苗提高了49.1%，差異達顯著水平；鹽脅迫下，自根苗和嫁接苗 SOD活性分別降低了49.7%，26.4%，均顯著低于對照，但嫁接苗降低幅度顯著低于自根苗。

非鹽脅迫條件下，嫁接苗POD活性比自根苗提高了50.2%，差異達顯著水平；鹽脅迫下，自根苗POD活性降低了46.7%，顯著低于對照；嫁接苗POD活性降低了16.6%，與對照差異不顯著。

非鹽脅迫條件下，嫁接苗APX活性比自根苗提高了79.1%，差異達顯著水平；鹽脅迫下，自根苗POD活性降低了50.6%，顯著低于對照；嫁接苗APX活性降低了22.9%，與對照無顯著差異。

由以上結(jié)果可知，非鹽脅迫條件下，嫁接苗葉片中SOD，POD，APX活性均高于自根苗；鹽脅迫處理后，各酶活性均呈現(xiàn)不同程度的降低，但嫁接苗中的酶活性降低程度顯著低于自根苗，說明嫁接后西瓜植株能維持較強的抗氧化物酶活性。

2.3 西瓜自根苗和嫁接苗葉片同工酶的變化

由圖2-SOD可知，嫁接苗和自根苗葉片SOD同工酶有 4條相同帶，Rf分別為 0.461，0.643，0.870，0.928。其中，0.461，0.643兩條帶寬且散，其他兩條比較集中，嫁接苗譜帶強度較自根苗強。鹽脅迫后，譜帶強度均減弱，但自根苗減弱程度大（Rf=0.928的譜帶極弱）。

由圖2-POD可知，自根苗和嫁接苗葉片中POD同工酶有5條相同帶，Rf分別為0.447，0.470，0.501，0.577，0.688，鹽脅迫后強度均變?nèi)?，自根苗變?nèi)醭潭却?。Rf為0.422的帶僅在自根苗中出現(xiàn)，鹽脅迫后強度變?nèi)酰籖f為0.255，0.650是嫁接苗的2條特異帶，鹽脅迫后強度變?nèi)酰?.255的帶下移。

如圖2-APX所示，自根苗和嫁接苗葉片中APX同工酶有3條相同帶，Rf分別為0.445，0.637，0.930，鹽脅迫后各帶強度均變?nèi)酰藿用缱內(nèi)鯊姸容^小。Rf為0.280的帶是嫁接苗的特異條帶，處理后變?nèi)跚蚁乱啤?/p>

圖2 嫁接對NaCl脅迫下西瓜植株葉片SOD，POD，APX同工酶的影響

3 結(jié)論與討論

有研究表明，鹽脅迫對植物的傷害最終體現(xiàn)在生長受到抑制，生物量積累下降，而嫁接能緩解其抑制程度[15～16]。本研究表明，西瓜嫁接苗的生物積累量顯著高于自根苗，這與Martinez-Rodriguez等[17]的報道相一致；鹽脅迫嚴重抑制了自根苗生物量的積累，而嫁接苗生物積累量的下降幅度明顯小于自根苗，表明嫁接苗對鹽脅迫的適應(yīng)性強于自根苗，嫁接可緩解鹽脅迫對植株的傷害，這與張古文等[18]的報道相一致。

正常條件下，植物依靠自身的自由基清除系統(tǒng)，保持細胞內(nèi)活性氧的平衡[19]，而當植物受到重金屬等脅迫時，活性氧平衡受到破壞，其清除系統(tǒng)尤其是抗氧化酶類如SOD，POD，APX則會表現(xiàn)出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，緩解脅迫對植株膜系統(tǒng)造成的傷害，但隨脅迫時間延長，這種效應(yīng)將會減弱[20～21]。 張玉鑫等[22]研究認為，鹽脅迫下甜瓜抗氧化物酶活性升高，且耐性強的甜瓜品種酶活性高于耐性弱的品種。但Davenport等[23]研究表明，采用175 mmol/L NaCl脅迫處理向日葵，葉片SOD，POD酶活性對NaCl脅迫的響應(yīng)具有時間依賴性，短期處理下酶活性上升，但在長期處理下酶活性下降。本試驗結(jié)果表明，鹽脅迫處理后，西瓜自根苗和嫁接苗抗氧化酶活性均降低，但嫁接苗降低幅度顯著小于自根苗?？寡趸锩富钚韵陆?，不能有效地清除鹽脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，膜脂過氧化作用導致膜結(jié)構(gòu)破壞，是鹽脅迫對西瓜幼苗葉片細胞造成傷害的重要原因之一，這與毛桂蓮等[24]的研究相一致。另外，許多研究表明，植物在遭受逆境脅迫時，植物能通過提高細胞內(nèi)防御機制，啟動一系列生理生化過程，把胞外信息傳遞給胞內(nèi)受體，調(diào)節(jié)基因表達，使得體內(nèi)一些酶的同工酶發(fā)生變化[25]?？寡趸锩甘菍Νh(huán)境條件十分敏感的酶類，其活性和同工酶譜的變化在一定程度上能反映植物抗鹽性的強弱[28]，SOD，POD，APX為相應(yīng)基因表達的產(chǎn)物。本試驗表明，正常營養(yǎng)液培養(yǎng)下，嫁接苗SOD，POD，APX同工酶活性提高，且酶帶強度增強，說明嫁接可能在誘導SOD，POD，APX同工酶基因表達的過程中具有重要作用；鹽脅迫下，自根苗和嫁接苗酶活性降低，且同工酶酶帶強度降低，酶譜有增減，出現(xiàn)了條帶的遷移，這表明在NaCl脅迫下，自根苗和嫁接苗的基因表達可能發(fā)生了變化，使得一些同工酶（如POD等）的合成受阻或被降解，活性降低或喪失，使得一些酶帶消失；同時嫁接也可能活化了某些基因，或增強了某些基因的表達，或者兩者均可，一些同工酶被激活，甚至誘導其他類型相關(guān)基因新的多肽合成啟動，酶的活性增強，產(chǎn)生新的譜帶（嫁接苗產(chǎn)生Rf為0.255，0.306，0.650 POD譜帶），這與前人的研究結(jié)果相一致[26]。

對不同植物SOD同工酶基本譜型的比較分析表明，不同植物雖然在酶帶條數(shù)和酶帶遷移率上有其特異性，但由于SOD是進化上高度保守的酶，多數(shù)植物存在共有帶[27]。在本試驗中，嫁接沒有產(chǎn)生特異帶，鹽脅迫下也沒有產(chǎn)生特異帶，表明SOD是進化上比較保守的酶，與前人研究結(jié)果相一致[26]。

過氧化物酶（POD）是一種適應(yīng)性酶，對不良環(huán)境的影響十分敏感，如小麥在受精胺[28]等處理時都會引起酶活性的改變和同功酶條帶的增加或減少。本試驗表明，自根苗和嫁接苗有5條相同帶；對照自根苗葉片中POD有1條特異帶，對照嫁接苗有2條特異帶。鹽脅迫下，各處理下譜帶強度變?nèi)酰藿用鐥l帶減弱程度小，且出現(xiàn)了條帶的遷移 （Rf= 0.255），表明嫁接可緩解其減弱程度，能夠減緩鹽脅迫對幼苗的傷害。

逆境脅迫下，植物體內(nèi)會積累過量的H2O2，它是一種對植物細胞和組織既有一定生理作用又有一定毒害作用的活性氧[29]，而APX可以直接清除H2O2。因此，APX活力的大小與H2O2的積累有直接關(guān)系。本試驗表明，自根苗和嫁接苗APX有3條相同帶，嫁接苗中有1條特異帶；鹽脅迫下，自根苗、嫁接苗各條帶強度均減弱，但自根苗的減弱程度較大，這也表明嫁接可以緩解鹽脅迫對幼苗的傷害。

從酶活性和同工酶酶譜變化來看，鹽脅迫下，SOD，POD，APX酶活性在自根苗中變化較大，在同工酶酶譜上也存在強度的差異，POD出現(xiàn)1條特異帶，但SOD，APX未出現(xiàn)譜帶的增加或減少，這表明鹽脅迫能改變自根苗POD同工酶基因的表達。而在嫁接苗中的變化比較復雜，除酶活性、酶譜強度有變化外，而且POD產(chǎn)生多條特異帶，表明嫁接能明顯改變同工酶基因的表達，且程度強于鹽脅迫，這也許是嫁接緩解植株鹽脅迫傷害的原因之一。

本試驗結(jié)果表明，嫁接可提高西瓜植株的生物量及葉片SOD，POD，APX酶活性，鹽脅迫下表現(xiàn)得更為明顯；在同工酶酶譜表達上，嫁接苗中的酶譜變化比較復雜，產(chǎn)生較多的特異條帶，體現(xiàn)出較強的植株耐鹽性。

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Effects of Grafting on the Isozymes and Activities of Antioxidant Enzymes of Watermelon Leaves under NaCl Stress

LIU Xiang’e,GUO Shirong,TIAN Jing,DUAN Jiuju,DU Changxia
(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Southern Vegetable Crop Genetic
Improvement,Ministry of Agriculture,Nanjing 210095)

The effects of NaCl stress on the isozymes and activities of SOD,POD,APX of the watermelon leaves of grafted scion-root plants and scion-root plants of mini-watermelon were studied with"Chaofengkangshengwang",a salt-tolerant variety,as the rootstock and"Xiuli",a salt-sensitive cultivar,as the scion.The results showed that under NaCl stress,the SOD,POD,APX activities in the leaves of the grafted plants were inhibited less than those in the leaves of scion-root plants.Grafting induced specific bands,significantly expressed.The results showed that grafting could regulate isozyme gene,grafted plants performed better in salt tolerance than the scion-root plants.Grafting could adjust the isozymes and activity of antioxidant enzymes of watermelon,and reduce the effect of NaCl stress on watermelon.

Grafting;NaCl stress;Mini watermelon;Isozymes;Activities of enzymes

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.02.006

農(nóng)業(yè)部行業(yè)公益性項目（nyhyzx07-007）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃資助（2009CB119000）；江蘇省自然科學基金（BK2006140）；江蘇省農(nóng)業(yè)三項工程項目（SX(2008)026）；國家科技支撐計劃（2006BAD07B04）資助

劉香娥（1983-），女，碩士研究生，主要從事蔬菜作物逆境生理研究。

郭世榮，通信作者，E-mail：srguo@njau.edu.cn

2009-01-21