骨髓基質(zhì)干細胞臨床研究進展

欽　斌　蔡建平

[摘要] 隨著細胞研究的發(fā)展，骨髓基質(zhì)干細胞的臨床應用越來越受到重視。本文對骨髓基質(zhì)干細胞的生物學特性、取材、分離、培養(yǎng)、臨床前期研究成果和面臨的問題進行了綜述。

[關(guān)鍵詞] 骨髓基質(zhì)干細胞；生物學特性；取材；分離；培養(yǎng)；臨床應用

[中圖分類號] R329.2[文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210（2009）02（a）-011－０2

1867年，Cohnheim首先提出了骨髓內(nèi)含有骨髓基質(zhì)干細胞（MSCs）的觀點；而Frieden-stein于1966年首先發(fā)現(xiàn)，它是骨髓基質(zhì)的組成成分，能分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。骨髓是由造血干細胞和非造血干細胞組成的器官，非造血干細胞（即MSCs）由骨前體細胞、軟骨前體細胞、脂肪前體細胞、神經(jīng)細胞和肌細胞前體細胞組成，因此，MSCs是由骨髓組織干細胞或前體細胞和軀體組織干細胞組成的成分及功能復雜的細胞群體[1]。許多年來，MSCs基礎(chǔ)研究和臨床應用的前期研究取得了重大進展，但是仍有許多問題尚待解決。

1細胞形態(tài)

MSCs具有3種細胞形態(tài)：①梭形細胞；②巨大扁平細胞；③體積非常小的球形細胞[2]。

2生物學特性

MSCs有以下生物學特性：①自我更新能力。MSCs在體內(nèi)具有很強的自我更新能力，是傳代細胞[3]。②很強的黏附性。體外培養(yǎng)收集細胞時MSCs容易與骨髓基質(zhì)分離形成細胞懸液，體外低密度培養(yǎng)時MSCs迅速黏附，反復沖洗可與非黏附的造血干細胞分離[2]。③可塑性。MSCs具有可塑性，即具有多向分化的潛能。骨髓脂肪細胞株在體內(nèi)可分化為真正的骨組織[4]，骨髓網(wǎng)狀細胞在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯毎?。在適宜的微環(huán)境下，MSCs可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、星形細胞、少突樹突細胞及神經(jīng)細胞等，而且能跨胚層分化，屬于不同胚層的MSCs或前體細胞還能分化成與本身組織不相關(guān)的其他胚層組織，如骨髓中存在成肌細胞前體細胞，神經(jīng)干細胞能重新分化成造血細胞，骨髓細胞分化為神經(jīng)細胞和肝細胞[5-7]。④快速增殖形成克隆的能力。MSCs能迅速產(chǎn)生單細胞源克隆，而且這些克隆均來源于單細胞克隆-克隆形成單位成纖維細胞（CFU-F）[5-7]。⑤可移植性。MSCs具有自我更新能力和可塑性，因此具備了可以移植的前提條件。一些臨床前期研究表明MSCs移植可治療某些疾病。

3生物學特性的改變

MSCs在體內(nèi)骨髓微環(huán)境下生長并保持特有的生物學特性，但經(jīng)體外適宜環(huán)境條件下培養(yǎng)后，許多生物學特性發(fā)生改變。①“歸巢”能力喪失。大多數(shù)研究表明，原代MSCs體外培養(yǎng)并輸注移植后，在受體中不能檢測到或只能部分檢測到供體的MSCs[8]。②分化潛能喪失。MSCs體外培養(yǎng)后，有的失去分化成脂肪細胞的能力，有的失去分化成軟骨細胞和成骨細胞的能力[9，10]。③細胞形態(tài)異質(zhì)性喪失。原代MSCs具有細胞形態(tài)的異質(zhì)性，但經(jīng)過一定時間的體外培養(yǎng)（傳代3次），形態(tài)的異質(zhì)性逐漸喪失，細胞形態(tài)主要為巨大扁平細胞[11]。④細胞融合入或核融合。當人MSCs與熱休克損傷的上皮細胞共同培養(yǎng)時，部分細胞直接轉(zhuǎn)化成上皮細胞而與其他細胞或上皮細胞融合變成雙核細胞且表達上皮細胞表面抗原[12]。細胞融合入或核融合的機制和生物學意義目前尚未明確。

4細胞的采集和培養(yǎng)

MSCs的取材一般采用骨髓穿刺法，操作方便，創(chuàng)傷小，可反復取材而不影響細胞活力及機體功能。分離骨髓基質(zhì)細胞的方法主要有三種：貼壁篩選法、密度梯度離心法和流式細胞分選術(shù)（flow cytometer，F(xiàn)CM）。貼壁篩選法經(jīng)濟方便但純化程度有限，有待進一步改進。密度梯度離心法得到的細胞純度可達95%[13]。流式細胞分選術(shù)可根據(jù)MSCs與造血細胞的表面標記的不同，用帶有熒光標記的抗體從混合細胞群中獲取高純度的MSCs。BioWhittaker Inc.用表面分子CD105、CD166、CD29、CD44陽性和CD14、CD34、CD45陰性篩選法得到幾乎完全純化的MSCs[14]。

靜態(tài)單層培養(yǎng)法是目前較為經(jīng)典的細胞培養(yǎng)方法。這種方法簡便易操作，成本低廉；缺點是培養(yǎng)細胞數(shù)量受培養(yǎng)器皿底面積限制，且不符合體內(nèi)的生理環(huán)境。隨著骨組織工程的研究，構(gòu)建功能性組織工程骨已成為理想目標，進而對種子細胞的培養(yǎng)提出了更高的要求。生物反應器的使用使得MSCs的體外動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境更接近于體內(nèi)，從而使種子細胞功能形狀等各方面更加完善。有研究表明，運用灌流式生物反應器不但可以進行多組織培養(yǎng)，而且還可以獲得4.22×107/ml的細胞密度，長時間培養(yǎng)仍能保持細胞的多分化特性[15]。

MSCs體外培養(yǎng)需要種子數(shù)量較大，使用常規(guī)的培養(yǎng)方法往往需要長時間培養(yǎng)、多次傳代才能完成。微載體培養(yǎng)法[16]在這一方面具有顯著的優(yōu)點：①兼有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點，且是均相培養(yǎng)；②細胞所處的培養(yǎng)環(huán)境均一；③培養(yǎng)條件（溫度、pH值、CO2等）容易調(diào)節(jié)和監(jiān)控；④具有較高的比表面積，培養(yǎng)的細胞數(shù)量更多；⑤培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動化，減少了發(fā)生污染的機會。

5臨床應用

MSCs具有可塑性和可移植性，因此它與骨髓造血干細胞一樣，具有重要的臨床治療價值。如何應用MSCs進行臨床治療是目前研究的熱點。目前常用的應用方法有：①作為轉(zhuǎn)基因靶細胞。用腺病毒把目的基因轉(zhuǎn)入MSCs，然后再把它們移植到相關(guān)的受損組織或器官。②MSCs體外擴增后靜脈輸注移植[17]。③MSCs局部移植。MSCs局部注射到關(guān)節(jié)腔可刺激軟骨細胞再生，延緩關(guān)節(jié)進行性破壞；注射到冠狀動脈可使心臟缺血區(qū)心肌細胞再生；注射到腦缺血壞死灶區(qū)能誘導新的神經(jīng)細胞再生。MSCs作為種子細胞具有廣泛的臨床治療譜。

基礎(chǔ)研究和臨床研究表明，MSCs具有廣泛的臨床應用前景，但臨床應用還有很多需要逾越的障礙。MSCs體外培養(yǎng)后細胞會衰老，增殖能力下降[18]；MSCs體外培養(yǎng)時會喪失部分或大部分多向分化的能力[9，10]，出現(xiàn)這種機制的原因不明，也沒有解決辦法。體外培養(yǎng)時MSCs喪失“歸巢”能力，不能到達髓或脾臟等目的器官[19]。動物模型研究表明，輸注移植骨髓前體細胞在受體體內(nèi)只能獲得有限的移植細胞，成肌細胞及其他細胞通過全是循環(huán)后到達肌肉組織的，細胞數(shù)量有限。目前的前期臨床研究表明，雖然少量供體的MSCs能在受體體內(nèi)存活，但大量證據(jù)表明MSCs不能通過全身輸注來移植[20]。

MSCs的研究已經(jīng)歷了30多年，對它的生物學特性也有了相當?shù)牧私?，許多前期臨床研究展現(xiàn)了廣泛而誘人的臨床治療前景。國內(nèi)外對自體骨髓基質(zhì)干細胞的基礎(chǔ)與臨床研究，主要集中于細胞體外培養(yǎng)擴增后再植入體內(nèi)方面，但是存在著患者等待治療時間長、所需治療費用昂貴以及倫理學要求等諸多不足，因而嚴重限制了其在臨床上的應用與推廣。目前應用自體骨髓基質(zhì)干細胞通過濃集技術(shù)（提高骨髓基質(zhì)干細胞的濃度）再與骨形態(tài)生長蛋白（BMP）、自體骨及多孔生物陶瓷材料復合，然后種植于機體內(nèi)使其成骨，治療骨缺損等疾病，將會成為研究熱點。

[參考文獻]

[1]Deng W, Obrocka M, Fischer I, et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP [J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,282(1):148-152.

[2]Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, et al. Bone marrow stromal cell, biology, and potential application [J]. Stem Cell,2001,19(3):180-192.

[3]Phinney DG. Jaw bone augmentation using tooth primordium[J]. J Cell Biochem Suppl,2002,38:7-12.

[4]Beresford JN, Bennet JH, Devlin, C, et al. Evidence for an inverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells [J]. J Cell Sci,1992,102:341-351.

[5]Bjornson CR, Rietze RL, Reynolds BA, et al. Ground-breaking stem-cell work has been reproduced [J]. Science,1999,283(5401):534-537.

[6]Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo [J]. Nat Med,2000,6:1229-1234.

[7]Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery [J]. J Neurosce Res,2000,61(4):364-370.

[8]Koc ON, Peters C, Aubourg P, et al. Human mesenchymal stem cells persist, demonstrate site-specific multipotential differentiation, and are present in sites of wound healing and tissue regeneration after transplantation into fetal sheep [J]. Blood Cells, Molecules, and Diseases,1999,27(11):1675-1681.

[9]DiGirolamo CM, Stokes D, Colter D, et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow [J]. Br J Haematol,1999,107(2):275-281.

[10]Sckiya I, Colter DC, Prockop DJ. Microchimerism and stem cell transplantation in multiple sclerosis [J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,284(2):411-418.

[11]Colter DC, Sekiya I, Prochop DJ. Marrow stromal cells mifrate throughout forebrain and cerebellum[J]. Roc Natl Acad Sci USA,2001,98(14):7841-7845.

[12]Spees JL, Olson SD, Ylostalo J, et al. Stem cell reviews and reports [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(5):2397-2402.

[13]裴國獻,金丹.骨組織工程學種子細胞研究進展[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2003,3(1):55-58.

[14]Akino K, Mineta T, FukuiM, et al. Bone morphogene ticprotein-2 regulates proliferation of human mesenchymalstem cells [J]. Wound Repair Regen,2003,11(5):354-360.

[15]Zhao F, Ma T. Perfusion bioreactor system for human mesenchymalstem cell tissue engineering dynamic cell seeding and construct development [J]. Biotechnol Bioeng,2005,91(40):482-493.

[16]周曉東,王常勇,毛天球,等.微載體懸浮培養(yǎng)體系對人脂肪基質(zhì)干細胞增殖與分化的影響[J].中國臨床康復,2005,9(22):62-64.

[17]Shi S, Gronthos S, Chen S, et al. Mesenchymal stem cells[J]. Nat Biotechnol,2002,20(6):587-591.

[18]Muraglia A, Canoedda R, Quarto RJ. Cultured bone on biomaterial substrates [J]. Cell Sci,2000,113(7):1161-1166.

[19]Rombouts WJ, Ploemacher RE. Targeting FLT3 kinase in acute myelogenous leukemia: progress, perils and prospects[J]. Leukemia,2003,17(1):160-170.

[20]Bianco P, Gehron-Robey P. Marrow stromal stem cells [J]. J Clin Invest,2000,105(12):1663-1668.

（收稿日期：2009-01-07）