５－氨基乙酰丙酸代謝產(chǎn)物原卟啉ＩＸ在葡萄酒色斑動物模型雞冠中的積聚

李　偉　周兆平　橋本賢二

[摘要]目的：研究5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）在不同給藥途徑下其代謝產(chǎn)物原卟啉IX （protoporphyrin IX,PpIX）在葡萄酒色斑動物模型雞冠中的聚集、分布的動態(tài)變化，探討其治療葡萄酒色斑的可行性。方法：以雞冠為模型，靜脈或局部真皮內(nèi)注射ALA后，應(yīng)用多通道光量子分析儀監(jiān)測代謝產(chǎn)物PpIX的動態(tài)變化，組織取材切片后用共聚焦顯微鏡檢測PpIX的分布。結(jié)果：在雞冠組織內(nèi)，ALA給藥后3h PpIX出現(xiàn)明顯聚集，分別在給藥5h（靜脈給藥組）和4h（局部給藥組）后到達(dá)高峰，靜脈給藥組峰值（94±15）units略高于局部給藥組（73±12）units。在身體其它部位的皮膚中，PpIX聚集規(guī)律相似，但局部給藥組的峰值（38±14）units明顯低于靜脈組（109±14）units。組織切片熒光檢測顯示PpIX彌漫性分布于真皮層中。結(jié)論：ALA的局部真皮內(nèi)注射比全身給藥用藥量小，但能達(dá)到同樣程度PpIX的積聚，有望成為葡萄酒色斑光動力學(xué)治療的新光敏劑。

[關(guān)鍵詞]5-氨基乙酰丙酸；葡萄酒色斑；原卟啉IX

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）01-0060-04

Accumulation of protoporphyrin IX in chicken comb after 5-aminolevulinic acid administration LI Wei1,ZHOU Zhao-ping1,HASHIMOTO Kenji2

(1.Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai 9th People's Hospital,School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200011,China; 2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hamamatsu University School of Medicine, Hamamatsu, Japan)

Abstract： ObjectiveThe purpose of this study is to investigate the accumulation kinetics and the localization of endogenously synthesized protoporphyrin IX (PpIX) after administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) in chicken comb.MethodsThe kinetics of PpIX accumulation after ALA administration through intradermal or intravenous injection was monitored for 24 hours, and the localization of PpIX was observed under confocal microscope.ResultsIn the comb, PpIX accumulation achieved the peak level at 5 and 4 hours after intravenous or intradermal injection of ALA, respectively, and almost completely eliminated within 24 hours. Similar amount of PpIX was observed after local and systemic injection. In the body skin, a similar pattern of PpIX accumulation kinetics was observed, but the PpIX level was much lower in the local injection group. Confocal microscope showed that PpIX distributed evenly in dermis without significant difference between two groups.ConclusionsIntradermal injection of 5-ALA is a safer administration route that could achieve equivalent of PpIX accumulation. It might be applicable to the clinical treatment of port-wine stains.

Key words: 5-aminolevulinic acid; port-wine stains; protoporphyrin IX

葡萄酒色斑是一種臨床常見的先天性血管疾病，其病理特征是真皮內(nèi)廣泛的毛細(xì)血管或微靜脈擴(kuò)張，最新分類歸為微靜脈畸形[1]。脈沖染料激光治療是目前標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，但僅有20%左右的病例可完全消退[2]。早在20世紀(jì)90年代，顧瑛等最先證實(shí)光動力療法是治療葡萄酒色斑的另一有效手段[3]，并在后續(xù)的研究中得到了肯定[4]。然而，該治療中常用的光敏劑，如血卟啉衍生物等，代謝慢，體內(nèi)殘留時間長。為避免藥物殘留導(dǎo)致的皮膚光毒性反應(yīng)，患者通常須在治療后避光一個月，這給病人的日常生活和工作帶來極大的不便。

5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）是血紅素合成過程中的原料，本身并不是光敏劑，它在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)酶催化后可轉(zhuǎn)變成光敏劑原卟啉IX (protoporphyrin IX, PpIX)，PpIX 經(jīng)進(jìn)一步酶催化后轉(zhuǎn)變成血紅素。當(dāng)有大量外源性ALA存在時，可造成PpIX 在細(xì)胞內(nèi)的快速積聚[5]，此時如接受適當(dāng)波長的激光照射，可引起光化學(xué)反應(yīng)而造成細(xì)胞損傷。根據(jù)這一原理，ALA已被廣泛用于淺表型皮膚癌、口腔癌、呼吸道以及消化道管腔腫瘤的光動力學(xué)治療中。研究發(fā)現(xiàn)，ALA介導(dǎo)的光動力療法治除了對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用外，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞以造成腫瘤局部微血管的阻塞是另外一條重要機(jī)制[5]。根據(jù)這一原理，我們推測它可能也適用于葡萄酒色斑的治療。因此，本研究開展了ALA在葡萄酒色斑動物模型雞冠中的藥代動力學(xué)變化和代謝產(chǎn)物PpIX分布的研究，探討ALA介導(dǎo)的光動力學(xué)作用在葡萄酒色斑治療中的可行性。雞冠因其含有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上與臨床葡萄酒色斑非常相似，因而常被用作研究葡萄酒色斑的動物模型。

1材料和方法

1.1 光敏劑：ALA購自日本Cosmos Bio公司，使用前在磷酸緩沖液中溶解，添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5。為保證藥物活性，溶液在每次實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物：取16只成年萊杭母雞（體重約1.5～2kg/只），肌肉注射氯胺酮（15mg/kg）和塞拉嗪 （0.6mg/kg）麻醉。

1.3 動態(tài)熒光檢測：16只雞均分兩組，分別經(jīng)靜脈（200mg/kg）或局部真皮內(nèi)注射（10mg/cm2/ml）ALA，應(yīng)用多通道光量子分析儀PMA-10（Hamamatsu Photonics K.K., 日本）在24h內(nèi)定時活體檢測組織內(nèi)代謝產(chǎn)物PpIX的含量。每只動物檢測雞冠的兩個不同區(qū)域，同時檢測遠(yuǎn)離雞冠的大腿外側(cè)兩個區(qū)域，各檢測點(diǎn)直徑為2.5mm。

1.4 PpIX組織學(xué)分布：給藥后5h，取0.5cm2雞冠組織做冰凍切片，在共聚焦顯微鏡（MRC600, Nippon Bio-RAD Laboratories，日本）下觀察PpIX分布，熒光分析軟件計算相關(guān)區(qū)域熒光強(qiáng)度，以給藥前雞冠組織為正常對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理：組織內(nèi)各時間點(diǎn)PpIX的積聚量以（x±s）表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用student t test分析，P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1 PpIX積聚動態(tài)變化：多通道光量子分析儀PMA-10由光源、雙孔探頭、光纖、色譜儀和計算機(jī)系統(tǒng)組成。檢測時410nm的激發(fā)光經(jīng)雙孔探頭的一個孔照射到檢測部位，激發(fā)后產(chǎn)生的局部組織熒光經(jīng)雙孔探頭的另一個孔傳入色譜檢測儀，經(jīng)計算機(jī)處理分析300～800nm的波譜。圖1顯示了PMA-10 檢測的典型吸光圖譜，波長636nm為PpIX的吸收峰，其峰值高低反映了PpIX的聚集程度?？梢钥吹紸LA注射前（0h）波長636nm處未見波峰，注射后5h波峰明顯，24h后則基本消退。動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)無論是靜脈給藥還是局部真皮內(nèi)注射，在雞冠部位（圖2），給藥后3hPpIX顯著積聚，分別在5h（靜脈給藥組）和4h（局部給藥組）到達(dá)高峰，靜脈給藥組峰值（94±15）units略高于局部給藥組（73±12）units，但無顯著性差異（P>0.05,n=16）。隨后PpIX聚集逐漸降低，24h后消退。在遠(yuǎn)離雞冠的大腿外側(cè)皮膚（圖3），PpIX動態(tài)變化規(guī)律與雞冠部位相似，給藥后3hPpIX濃度明顯升高，靜脈給藥組在8h到達(dá)高峰，局部給藥在4h到達(dá)高峰組，但局部給藥組的峰值（38±14）units顯著低于靜脈組（109±14）units（P<0.05, n=16）。

2.2PpIX組織分布：為了了解PpIX在組織中的分布情況，我們在ALA給藥后5h切取雞冠。由于石蠟切片自發(fā)熒光強(qiáng)，而且在脫蠟處理中會造成PpIX的丟失與熒光淬滅，我們采用冰凍切片后在共聚焦顯微鏡下觀察PpIX熒光的分布。與未給藥組相比，給藥組真皮部位都有彌漫性的PpIX熒光分布（圖4），靜脈給藥組與局部給藥組分布無明顯差異，未見血管樣結(jié)構(gòu)周圍熒光聚集的現(xiàn)象。而在表皮層，由于表皮自發(fā)熒光強(qiáng)，三組未見明顯差異。熒光強(qiáng)度軟件分析結(jié)果可較清楚地看到給藥組真皮層內(nèi)熒光的均勻分布。

3討論

由外源性ALA引起的細(xì)胞內(nèi)PpIX聚集，與血紅素代謝過程中細(xì)胞內(nèi)的兩種酶活性有關(guān)：一種是催化ALA轉(zhuǎn)變成PpIX的酶，另一種是催化PpIX轉(zhuǎn)變成血紅素的酶。當(dāng)前者活性高、后者活性低時，會造成細(xì)胞內(nèi)PpIX的短暫聚集。利用不同細(xì)胞間這兩種酶活性的差異，在給予外源性ALA后，可引起PpIX在不同細(xì)胞內(nèi)的差異性聚集，經(jīng)進(jìn)一步光激活，可造成選擇性的細(xì)胞損傷[5]。一些腫瘤細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞由于酶活性與其他細(xì)胞不同而容易形成PpIX的聚集，成為ALA介導(dǎo)的光動力療法的靶細(xì)胞[5]。該療法對毛細(xì)血管的特異性損傷作用在腫瘤治療中得到了證實(shí)，同時研究證明它對正常毛細(xì)血管也有作用[6]，因此ALA介導(dǎo)的光動力療法很有可能成為治療皮膚毛細(xì)血管畸形的手段之一。

研究最初我們分別采用了靜脈注射、真皮內(nèi)注射以及表面涂敷的方法給予ALA，但表面涂敷給藥未見PpIX的顯著聚集（結(jié)果未顯示），這與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致，認(rèn)為ALA無法穿透正常的皮膚角質(zhì)層[5]。局部真皮內(nèi)注射與靜脈給藥在雞冠部位可以達(dá)到相同的PpIX聚集，而局部給藥造成皮膚其它部位PpIX的聚集遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于全身給藥組；即使在同一雞冠的不同部位，局部注射區(qū)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鄰近的非注射區(qū)（結(jié)果未顯示）。局部注射后引起的非注射區(qū)PpIX積聚，很可能是由于注射的ALA通過毛細(xì)血管進(jìn)入血液并分布到體內(nèi)其他部位造成的，但畢竟進(jìn)入血液的量較少，因此并不會造成非注射區(qū)PpIX的大量積聚。由此可見，局部用藥能在注射區(qū)達(dá)到同樣程度的PpIX積聚，并且優(yōu)于全身給藥，因?yàn)樗粌H可以大大減少用藥劑量，還能避免全身皮膚的光敏毒性作用。當(dāng)然，局部注射的缺陷在于注射不均勻，可能在光照后產(chǎn)生的效果不均勻，因此對于大面積的病變，全身給藥可能更合適。從動態(tài)監(jiān)測可以看到24h內(nèi)PpIX被基本代謝，與其他常用的光敏劑相比，它的半衰期明顯縮短。在臨床應(yīng)用中，這將大大縮短治療后的避光時間。

在皮膚及消化道淺表腫瘤的光動力學(xué)治療中，ALA的全身和局部給藥可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)PpIX積聚，同時也在腫瘤組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中積聚[4]。本研究中激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)PpIX在真皮層中彌漫性分布，并非局限于血管樣結(jié)構(gòu)周圍，提示PpIX的積聚可能同時存在于真皮中的主要細(xì)胞成分成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中。以往研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞在外源性ALA處理后能產(chǎn)生PpIX積聚[7]，并對進(jìn)一步的光照產(chǎn)生反應(yīng)。Chang等研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在ALA處理后有PpIX的聚集[8]，并在照射激光后細(xì)胞死亡。他們進(jìn)一步在雞冠模型中嘗試了全身給藥后照射激光治療，發(fā)現(xiàn)光照后照射部位的缺血性變化[8]，提示ALA介導(dǎo)的光動力療法治療葡萄酒色斑的可行性。然而，Evans等曾經(jīng)嘗試應(yīng)用在脈沖染料激光治療臨床葡萄酒色斑的同時輔助光動力治療，結(jié)果并未看到附加的效果[9]，他們在討論中提到一種可能是脈沖染料激光治療本身已造成足夠程度的血管損傷，輔助的光動力學(xué)作用不能體現(xiàn)；另一種可能是照射時間（全身給藥后1～2h）以及照射劑量不合適，不能達(dá)到治療效果。從本研究可以看到無論何種給藥方式，都能在真皮內(nèi)產(chǎn)生PpIX積聚，其高峰時間在用藥后4～5h，如果光照時間與劑量合適的話，理論上能達(dá)到治療效果。

總之，ALA的局部注射給藥可引起PpIX在局部的聚集，并能避免靜脈給藥造成的全身性光敏毒性副作用，其介導(dǎo)的光動力作用有待進(jìn)一步開展照光研究加以證實(shí)，ALA有望成為治療葡萄酒色斑的新光敏劑。

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[收稿日期]2008-09-25[修回日期]2008-12-10

編輯/張惠娟