角質(zhì)形成細胞生長因子的研究進展

郝曉艷　郭樹忠

角質(zhì)形成細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)是由間質(zhì)細胞分泌的，通過旁分泌途徑刺激上皮增殖的細胞因子。研究表明KGF在組織修復(fù)過程中發(fā)揮著很重要的作用，這些作用主要是KGF通過加強上皮屏障功能完成，包括促進細胞的增殖、遷移、分化、存活等。重組人角質(zhì)形成細胞生長因子Palifermin已由FDA批準(zhǔn)用于治療放化療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎。本文將對KGF的生物學(xué)特性、表達調(diào)控、生物學(xué)功能、及重組KGF的研究和應(yīng)用進行討論。

1KGF的生物學(xué)特性

角質(zhì)形成細胞生長因子（KGF）是1989 年由Rubin 等[1]首先從人胚胎肺成纖維細胞的生長培養(yǎng)液中分離出來的單鏈多肽，分子量為26～28 kDa。KGF 的cDNA 編碼194個氨基酸，包含一分泌所需的信號肽和N端的糖基化位點。重組人KGF（recombinant human KGF,rhKGF）在細菌中表達時，產(chǎn)生分子量21kDa的活性蛋白，rhKGF與天然的KGF分子量的差異主要是因為哺乳動物中表達的KGF進行了糖基化修飾，但這種翻譯后的修飾對于其生物活性不是必需的，而且rhKGF的活性約是從成纖維細胞培養(yǎng)液中分離得到的天然KGF的10倍?；蛐蛄蟹治霰砻鱇GF從屬于成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)家族,也稱FGF7。KGF與FGF1、FGF2相比，同源序列大約位于KGF編碼區(qū)羧基端的2/3處。在這個同源序列區(qū)，KGF與其它成纖維細胞生長因子家族成員約有30%～45%的同源性。除人胚胎肺成纖維細胞表達KGF外，很多組織的間質(zhì)細胞都可表達KGF，比如成年人的肺、皮膚、乳腺、胃、膀胱及前列腺等。最先一直認(rèn)為上皮細胞不表達KGF,后來的一些實驗證實KGF除主要表達于間質(zhì)細胞外，一些上皮細胞也可表達KGF,如豬子宮內(nèi)膜上皮、培養(yǎng)的牛卵巢上皮、及晶狀體上皮細胞。此外皮膚、胃腸道、陰道內(nèi)活化的細胞也可表達KGF，而內(nèi)皮內(nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)的細胞和細胞均檢測不到KGF的表達，而從胸腺分離的T細胞可表達KGF，CD3-、CD4－、CD8－的胸腺細胞未檢測出表達KGF，但CD4+、CD8+的胸腺細胞可表達KGF[2]。血管平滑肌細胞如猴子宮螺旋動脈平滑肌細胞、培養(yǎng)的人隱靜脈、髂動脈平滑肌細胞也可表達有活性的KGF。KGF在黑色素細胞和黑色素瘤細胞內(nèi)也可表達。KGF可作用于鼠上皮細胞、人乳腺上皮細胞、猴氣管上皮細胞、人角質(zhì)細胞、鼠和人前列腺上皮細胞、鼠肝細胞、2型肺泡細胞、角膜上皮細胞和牛卵巢顆粒細胞。KFG對成纖維細胞、靜脈內(nèi)皮細胞，黑色素細胞沒有作用。一直以來認(rèn)為KGF與其他FGF不同的是KGF的靶細胞僅為上皮細胞，但后來發(fā)現(xiàn)也可促進角膜及小血管內(nèi)皮細胞的增殖，而在這些細胞不能檢測到其特異性受體FGF2b的表達，所以KGF是否是通過其他高親和受體作用于血管內(nèi)皮，還有待進一步研究。

2KGF表達的調(diào)控

巨噬細胞和多形核粒細胞分泌大量的致炎因子IL-1和IL-6，IL-1和IL-6能促進成纖維細胞內(nèi)KGF基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成。角質(zhì)細胞本身分泌IL-1通過c-Jun和c-JunB轉(zhuǎn)錄因子刺激成纖維細胞表達KGF和GM-CSF，然后KGF和GM-CSF通過旁分泌的方式刺激角質(zhì)細胞增值和分化[3]。角質(zhì)細胞分泌的甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白也可刺激成纖維細胞表達KGF，然后KGF又通過旁分泌的方式促進角質(zhì)細胞的增殖和分化。局部出血導(dǎo)致血小板浸潤，釋放一系列生長因子，包括血小板源衍生生長因子(PDGF)和表皮生長因子，后者又刺激成纖維細胞表達KGF，通過KGF脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染鼠急性傷口發(fā)現(xiàn)PDGF表達水平與對照組相比沒有變化，這也進一步證實了PDGF在組織損傷修復(fù)過程中位于KGF信號的上游[4]。此外TNF- 也可刺激成纖維細胞表達KGF。性甾體類激素可通過作用于間質(zhì)細胞，使KGF的表達量上調(diào)來影響精囊、前列腺、子宮內(nèi)膜的上皮，雄激素刺激成年鼠前列腺的間質(zhì)細胞表達KGF，也可刺激正常人前列腺間質(zhì)細胞表達FGF-10，黃體酮和雌激素也能使KGF表達上調(diào)。糖皮質(zhì)激素對KGF的表達起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，地塞米松可減少KGF基因的轉(zhuǎn)錄以及減弱KGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

3KGF的生物學(xué)功能

KGF表達量上調(diào)見于鼠和人全層皮膚損傷、膀胱手術(shù)損傷、化療藥物導(dǎo)致的肝損傷、新生兔缺氧性肺損傷、博來霉素導(dǎo)致的急性肺損傷，人炎癥性腸病以及銀屑病。而在所有這些疾病中，上皮細胞均表達了KGF的特異性受體FGFR2b，這就提示KGF參與了各種上皮的保護和修復(fù)過程。KGF脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染鼠急性傷口后再上皮化加速、胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、KGF、FGF、VEGF和Ⅳ型膠原表達增加。Jeschke等[5]也證實了這一結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)IGF-1和KGFcDNA共轉(zhuǎn)染后VEGF表達量高于單一轉(zhuǎn)染，血管新生作用也可增強。KGF脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后PDGF的表達無差異，而 轉(zhuǎn)化生長因子的表達減少( GF-)，已知PDGF與傷口周圍早期炎癥反應(yīng)有關(guān)，TGF- 可促進Ⅰ型膠原的合成，從而導(dǎo)致瘢痕的發(fā)生。所以KGFcDNA治療促進再上皮化但同時即不加重炎癥反應(yīng)也不促進瘢痕形成。

促有絲分裂作用：KGF可促進細胞DNA的合成，如人和鼠角質(zhì)細胞、猴支氣管上皮細胞、人和鼠前列腺上皮細胞，鼠肝細胞、Ⅱ型肺泡細胞、角膜上皮細胞和牛卵巢顆粒細胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因與KGF的促有絲分裂作用相關(guān)，如c-myc、c-fos，這二者是多種細胞分化所必需的最初應(yīng)答基因。除此之外，還發(fā)現(xiàn)一些調(diào)控核酸合成的關(guān)鍵酶的基因，如腺苷酸琥珀酸裂解酶，以及嘌呤從頭合成和旁路合成的相關(guān)酶，添加KGF后，這些酶在HaCaT角質(zhì)細胞的表達上調(diào)，提示KGF與核酸的合成有關(guān)，為DNA的復(fù)制和RNA的合成提供足夠原料。另一個通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)與KGF促進DNA合成有關(guān)的基因是與酵母同源的CHL-1基因，這個基因編碼能使染色體分離的解螺旋酶。而且KGF 可誘導(dǎo)角質(zhì)細胞表達 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-，后者是另一種上皮促有絲分裂源，這就放大了KGF促上皮細胞的有絲分裂作用。

促進細胞遷移作用：KGF可通過劑量依賴性促進正常人角質(zhì)細胞的遷移，該作用可被KGF中和抗體抑制。KGF作用于角質(zhì)細胞使得角質(zhì)細胞對膠原和纖維連接蛋白的粘附能力增強，這便有利于角質(zhì)細胞在這些基質(zhì)上的遷移。KGF在體外實驗中也可誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡細胞的遷移。在再上皮化過程中，角質(zhì)細胞先脫離基底膜然后開始遷移，再上皮化過程還需降解傷口周圍的凝血塊、真皮及肉芽組織。多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)參與了這一過程。KGF可促進角質(zhì)細胞合成MMP-1，KGF也可直接誘導(dǎo)MMP-9、MMP-10、MMP-13以及尿激酶型纖維蛋白溶解酶原激活質(zhì)。這些提示KGF調(diào)控著傷口愈合組織重塑過程中酶的表達[6]。

調(diào)控細胞分化作用：KGF通過誘導(dǎo)角質(zhì)細胞終末分化的標(biāo)記分子來促進角質(zhì)細胞的分化，如誘導(dǎo)整合素的表達，延遲角蛋白和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達。GF也可影響肺上皮細胞的分化，在肺受到損傷后，Ⅱ型肺泡細胞分化成Ⅰ型肺泡細胞參與氣體交換。Ⅱ型肺泡細胞與KGF一同培養(yǎng)時，可長時間保持Ⅱ型肺泡細胞的形態(tài)，誘導(dǎo)成Ⅰ型肺泡細胞的時間也延長，Qiao等[7]進一步發(fā)現(xiàn)KGF通過激活c-Jun轉(zhuǎn)錄因子來維持Ⅱ型肺泡細胞形態(tài)。重組KGF可誘導(dǎo)胃腸道內(nèi)分泌粘蛋白的杯狀細胞的分化。KGF也可促進胰腺外分泌細胞分化成導(dǎo)管上皮細胞。

3.4 抗調(diào)亡作用：KGF可使放線菌D和腫瘤壞死因子TNF誘導(dǎo)的肝細胞凋亡減少。在全腸外營養(yǎng)的小鼠模型，胃腸道上皮細胞發(fā)生嚴(yán)重凋亡，給予KGF后可減少細胞凋亡以及增加抗凋亡蛋白Bal-2的表達[8]。在肺，KGF不僅刺激Ⅱ型肺泡細胞增殖，同時維持其形態(tài)，防止其凋亡以及分化成Ⅰ型肺泡細胞。KGF也可抑制缺氧誘導(dǎo)的肺上皮細胞發(fā)生凋亡，可能是通過抑制凋亡介導(dǎo)分子的表達，如p53、p21、Bax和Bcl-x。上文提到黃體酮可刺激KGF的表達，Slayden等[9]發(fā)現(xiàn)外源的KGF可抑制黃體期基底層細胞的凋亡，這對螺旋動脈的營養(yǎng)供給起重要影響。

3.5細胞保護作用：損傷使得KGF大量表達，并參與損傷組織的修復(fù)過程。而且KGF對外源致傷因子可能造成的細胞損傷具有防護作用。外源KGF可減輕高氧造成的肺損傷。氧化應(yīng)激最早效應(yīng)是細胞DNA鏈的斷裂，這將導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡或壞死。體外實驗證實KGF可減少高氧導(dǎo)致的A549肺泡上皮細胞DNA鏈的斷裂。KGF也可防止體內(nèi)缺氧誘導(dǎo)的肺上皮細胞死亡，它通過激活抗凋亡S6激酶、Akt信號旁路[10]。KGF可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞內(nèi)Nrf-2轉(zhuǎn)化因子的表達，而后者調(diào)控多種酶的表達，而這些酶對活性氧(ROS)具有解毒功能,皮膚損傷后巨噬細胞和中性粒細胞表達ROS水平很高，主要是防御入侵的細菌，但是ROS也破壞臨近細胞。因此KGF有效的細胞保護作用是通過加強對活性氧的解毒功能而實現(xiàn)的[11]。此外KGF也可同UVB一樣通過激活KGFR并誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞發(fā)生內(nèi)化，從而介導(dǎo)黑色素顆粒從黑色素細胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細胞，保護皮膚免于UVB的損傷[12]。

4重組KGF(rKGF)的研究

重組人角質(zhì)形成細胞生長因子Palifermin已由FDA批準(zhǔn)用于治療放化療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎，這就需要大量具有生物活性的rhKGF，但是rhKGF在細菌內(nèi)的產(chǎn)出率很低，有時甚至很難檢測到。研究者利用各種載體和宿主菌的多種不同的組合方式來表達KGF，以及嘗試KGF與谷胱甘肽(GST)融合表達，這雖然提高了KGF的表達量到3.2mg/L/OD600，但仍不及用同樣方法表達的FGF1、FGF2、FGF10的產(chǎn)量的1/10。后來研究者在培養(yǎng)基中加入10～100mM氯化鎂后，發(fā)現(xiàn)氯化鎂的用量在30mM時，GST-KGF融合蛋白在BL21(DE3)pLysS菌株的表達量最大，可達到17mg/L/OD600，而且氯化鎂的這種作用具有菌株特異性，氯化鎂不能提高在BL21(DE3)和DH5 菌株表達KGF的產(chǎn)量[13]。國內(nèi)游力[14]等應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，擴增出KGFcDNA基因，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，重組蛋白約占菌體蛋白10％。

5臨床應(yīng)用

重組人角質(zhì)形成細胞生長因子(palifermin)2004年由美國FDA批準(zhǔn)用于治療白血病患者高劑量化療或者聯(lián)合放療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎，商品名Kepivance。Palifermin為靜脈注射劑，在抗癌治療開始前后連續(xù)三天給藥，化療前后24h停藥，給藥劑量每天60mg/kg。Palifermin能減輕粘膜炎的嚴(yán)重程度和減少它的持續(xù)時間。Ellison等[15]通過實驗發(fā)現(xiàn)palifermin不光通過對上皮細胞的保護作用改善粘膜炎，而且可通過免疫調(diào)節(jié)作用來減少急性移植物抗宿主病的發(fā)生。

6總結(jié)與展望

KGF是一種多功能的生長因子，通過促進細胞的增殖、遷移、分化、存活、DNA修復(fù)以及誘導(dǎo)對活性氧具有解毒功能的酶的表達來加強上皮功能，從而保護上皮免于毒性物質(zhì)的損傷。但KGF的生物學(xué)性質(zhì)尚未全部了解，KGF主要通過與受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，但在有的病理生理過程中，KGF表達的上調(diào)并不伴隨其受體的表達上調(diào)，提示KGF是不是通過其它途徑發(fā)揮作用還有待進一步研究。Palifermin是首個應(yīng)用的改善放化療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎的藥物，隨著KGF作用機制的研究進展，相信KGF的臨床應(yīng)用范圍會更加廣泛。

[參考文獻]

[1]Rubin JS, Osada H, Finch PW, et al. Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(3)：802-806.

[2]Erickson M, Morkowski S, Lehar S, et al. Regulation of thymic epithelium by keratinocyte growth factor[J]. Blood,2002, 100(9): 3269-3278.

[3]厲孟,張琳西,夏煒,等.角質(zhì)形成細胞源促成纖維細胞增殖的細胞因子研究[J].中國美容醫(yī)學(xué),2006,15(4):374-376.

[4]Pereira CT, Herndon DN, Rocker R, et al. Liposomal gene transfer of keratinocyte growth factor improves wound healing byaltering growth factor and collagen expression[J]. J Surg Res, 2007,139(2):222-228.

[5]Jeschke MG, Herndon DN. The combination of IGF-I and KGF cDNA improves dermal and epidermal regeneration by increased VEGF expression and neovascularization[J].Gene Ther,2007, 14(16):1235-1242.

[6]GaliacyS, Planus E, Lepetit H, et al. Keratinocyte growth factor promotes cell motility during alveolar epithelial repair in vitro[J]. Exp Cell Res, 2003,283(2):215-229.

[7]Qiao R, Yan W, Clavijo C, et al. Effects of KGF on alveolar epithelial cell transdifferentiation are mediated by JNK signaling[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2008,38(2):239-246.

[8]Wildhaber BE, Yang H, Teitelbaum DH. Total parenteral nutrition-induced apoptosis in mouse intestinal epithelium: modulation by keratinocyte growth factor[J]. J Surg Res,2003, 112(2):144-151.

[9]Slayden OD, Rubin JS. Lacey DL, et al. Effects of keratinocyte growth factor in the endometrium of rhesus macaques during the luteal-follicular transition[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85(1): 275-285.

[10]Ray P, Devaux Y, Stolz DB, et al. Inducible expression of keratinocyte growth factor(KGF) in mice inhibits lung epithelial cell death induced by hyperoxia[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(10): 6098-6103.

[11]Braun S, Hanselmann C, Gassmann MG, et al. Nrf-2 transcription factor,a novel target of keratinocyte growth factor action which regulates gene expression and inflammation in the healing skin wound[J]. Mol Cell Biol, 2002,22(15):5492-5505.

[12]Cardinali G, Ceccarelli S, Kovacs D, et al. Keratinocyte growth factor promotes melanosome transfer to keratinocytes[J]. J Invest Dermatol, 2005,125(6):1190-1199.

[13]Luo Y, Cho HH, Jones RB, et al. Improved production of recombinant fibroblast growth factor7(FGF7/KGF) from bacteria in high magnesium chloride[J]. Protein Expr Purif, 2004,33(2):326-331.

[14]游力，趙躍然，高春義，等.人角質(zhì)細胞生長因子的克隆及表達[J].中國生物制品學(xué)雜志，2001,14（1）：21-23.

[15]Ellison CA, Makar BM, Wiseman JM, et al. Palifermin mediates immunoregulatory effects in addition to its cytoprotective effects in mice with acute graft-versus-host disease[J]. J Clin Immunol, 2008,28(5):600-615.

[收稿日期]2008-10-22[修回日期]2008-12-28

編輯/張惠娟