胚挽救技術(shù)應(yīng)用于無核葡萄育種的研究進(jìn)展

范春霞 周 燕 高述民 張小方

摘要植物的胚挽救技術(shù)在無核葡萄的育種研究中發(fā)展迅速,通過對胚挽救技術(shù)及其在無核葡萄育種上的應(yīng)用以及影響胚挽救的因素進(jìn)行綜述,指出了葡萄胚挽救技術(shù)存在的不足,并對其今后研究方向提出展望。

關(guān)鍵詞 胚挽救技術(shù);無核葡萄育種;應(yīng)用;研究進(jìn)展

中圖分類號S663.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)09-0019-02

無核鮮食葡萄（Vitis vinifera L．）一直深受廣大消費(fèi)者的喜愛。無核性狀作為葡萄重要的商品性狀是當(dāng)前葡萄育種的重要目標(biāo)之一。20世紀(jì)以有核品種為母本的有性雜交方式選育效益很低，隨著胚挽救技術(shù)的應(yīng)用，極大地縮短了無核葡萄選育的育種周期，使無核葡萄的育種有了長足地發(fā)展。將胚挽救技術(shù)用于無核葡萄育種是十分有效的，并為解決無核葡萄育種中的問題開辟了新思路。

1無核葡萄的胚挽救技術(shù)

無核葡萄根據(jù)其授粉結(jié)實的特性可分為2類：一類稱單性結(jié)實型（Parthenocarpy），就是卵細(xì)胞不經(jīng)過受精作用而直接發(fā)育成果實；另一類稱假單性結(jié)實型（Pseudo-Parthen-ocarpy），即種子敗育型（Stenospermocarpy），就是雖受精，但受精后的胚很快停止發(fā)育導(dǎo)致無核果實產(chǎn)生，這種類型的品種占無核品種的85%以上。

胚挽救技術(shù)就是通過選擇假單性結(jié)實類型的無核品種，在其合子胚敗育之前進(jìn)行人工離體培養(yǎng)，減少幼胚的敗育，利用胚乳及培養(yǎng)基中的營養(yǎng)使其發(fā)育成充實的胚，最終形成完整的植株。之前，以有核材料（母本）×無核材料（父本）的雜交方式培育的無核葡萄品種的無核比率很低，且選育1個品種的周期非常長（10年以上）?，F(xiàn)利用胚挽救方法可進(jìn)行“無核×無核”方式雜交，通過胚挽救其后代來培育無核品種，并結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，從而使無核比率成倍提高，且大大縮短了品種的選育時間。

2胚挽救技術(shù)在無核葡萄育種上的應(yīng)用

2.1培育無核葡萄品種

無核葡萄品種間雜交或以無核葡萄品種作母本進(jìn)行雜交是培育無核葡萄品種的有效途徑，而胚挽救技術(shù)使這種雜交方式成為現(xiàn)實。從Ramming等首次報道利用胚挽救技術(shù)獲得無核葡萄實生苗以來，世界各國利用該方法相繼獲得了許多無核葡萄新資源，且選育出優(yōu)良的無核葡萄品種。并通過深入研究基因型、培養(yǎng)基、取樣時期以及它們間的相互作用對無核葡萄胚珠培養(yǎng)的影響，建立了輔助無核葡萄育種的胚挽救技術(shù)程序[1]。我國自20世紀(jì)90年代后也相繼開展了此項研究，并打下了一定的實踐基礎(chǔ)。程和禾等[2]通過對接種時期、基本培養(yǎng)基和激素配比、低溫等因素的研究，建立了較為簡單實用的奧迪亞無核葡萄幼胚搶救體系，為奧迪亞無核葡萄作母本進(jìn)行雜交育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。唐冬梅、閆愛玲等通過大量試驗對胚挽救的多個影響因素進(jìn)行了進(jìn)一步地研究和驗證，更加完善了胚挽救技術(shù)在無核葡萄育種上的輔助應(yīng)用程序[3，4]。

2.2克服雜交不親和

遠(yuǎn)緣雜交是將野生種抗性基因組轉(zhuǎn)移至栽培品種，或?qū)⒉煌N的優(yōu)良基因重組的一種有效育種方式。由于遠(yuǎn)緣雜交雜種胚、胚乳和子房組織間缺乏協(xié)調(diào)性，致使雜種胚部分或全部壞死，有時受精后的幼胚不發(fā)育或中途停止發(fā)育，導(dǎo)致難以獲得雜種苗。胚挽救技術(shù)在克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性方面發(fā)揮了巨大的作用[1]。Goldy和Ramming等首先通過胚挽救技術(shù)，分別獲得了多株胚挽救苗。我國首次利用無核葡萄×中國野生葡萄雜交結(jié)合胚挽救技術(shù)，獲得51株雜種后代。李金月等[5]用無核葡萄與抗性強(qiáng)的有核葡萄雜交獲得無核、抗性強(qiáng)、可利用的雜種后代，改變了無核葡萄抗性差的弊端?？梢?，胚挽救技術(shù)是克服遠(yuǎn)緣雜交不育的一種有效方法。

2.3三倍體育種

三倍體育種是獲得優(yōu)質(zhì)大粒、抗病及抗逆性好的無核葡萄品種的重要途徑之一。獲得三倍體無核葡萄，最有希望的方法是二倍體與四倍體間的雜交。郭印山等對二倍體與四倍體葡萄雜種胚珠采取橫切的方法獲得了三倍體植株，并采用L25（55）的正交試驗證明了影響胚挽救成苗率最重要的是接種時間， 然后是各種植物激素的濃度[6]。而閆愛玲等[4]以二倍體葡萄為母本，與四倍體葡萄雜交，雜種進(jìn)行胚珠培養(yǎng)，獲得了三倍體植株，并通過試驗確定了不同成熟期胚挽救的取樣時期可以根據(jù)母本品種成熟期來確定。

2.4分子標(biāo)記技術(shù)輔助無核葡萄育種

分子標(biāo)記是DNA水平的標(biāo)記，能夠穩(wěn)定遺傳，可以反映生物個體和群體特性。由于常規(guī)育種中對目標(biāo)性狀選擇耗時、費(fèi)力且容易出現(xiàn)偏差，因此分子標(biāo)記在葡萄育種中的應(yīng)用將提高葡萄遺傳育種的效率和精確度，并可用于雜種后代的無核性、抗病性及抗寒性等品種的早期鑒定。有研究者先后采用RAPD方法及AFLP技術(shù)法對葡萄無核基因進(jìn)行了研究。Scott等[7]首次利用AFLP技術(shù)對Flame seedless 的突變體進(jìn)行早期鑒定。郭海江等[8]利用葡萄無核基因、抗黑痘病和抗炭疽病基因RAPD標(biāo)記，對多個胚挽救雜交后代進(jìn)行了抗病性輔助選擇。李金月等[5]對供試材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記，以驗證供試材料的抗寒性。這些研究成果為分子標(biāo)記輔助早期選擇無核葡萄育種提供了DNA依據(jù)。

3無核葡萄胚挽救育種的主要影響因素

3.1確定最佳胚挽救時期

為保證獲得雜交后的合子胚，一定要用假單性結(jié)實的無核葡萄作母本。在親本選擇時除保證無核性狀外，選擇并培育抗病、早熟大粒、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良性狀是目前的育種方向。無核葡萄胚的發(fā)育受基因型的嚴(yán)格控制。不同品種，甚至同一品種的不同植株，同一植株的不同部位，其胚發(fā)育期的長短是不同的。因此，研究胚敗育的過程，確定胚珠接種的最佳時期是胚挽救成功的前提[8]。有研究者通過無核葡萄與有核葡萄胚挽救雜交后代的抗寒性研究，證實了葡萄抗寒性具有母性遺傳現(xiàn)象。因此，在進(jìn)行葡萄的抗寒性雜交選育中，一定要注意親本特別是母本的選配[5]。

3.2培養(yǎng)基及激素的選擇

無核葡萄胚挽救中選擇適宜的培養(yǎng)基是獲得成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在胚挽救過程的不同培養(yǎng)階段所選用的基本培養(yǎng)基類型不同。在胚珠培養(yǎng)階段，大多數(shù)研究者認(rèn)為Nitsch 或NN 為胚發(fā)育的基本培養(yǎng)基效果良好，并經(jīng)過多年研究總結(jié)出了適合無核葡萄胚珠培養(yǎng)的ER培養(yǎng)基。在胚萌發(fā)和成苗培養(yǎng)階段，多數(shù)研究者認(rèn)為1/2MS 或Wood Plant（WP）培養(yǎng)基較好。經(jīng)研究比較ER和Nitsch 兩種固液雙層胚珠發(fā)育培養(yǎng)基對胚珠萌發(fā)的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者更適宜于無核葡萄雜種胚的萌發(fā)和胚狀體發(fā)生[9]。因此，在胚挽救過程中，注意基本培養(yǎng)基應(yīng)隨著胚的不同發(fā)育階段而進(jìn)行及時更換。在胚挽救中，無核葡萄胚珠培養(yǎng)適合在較高的銨態(tài)氮的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加活性炭和0.2~0.5mg/L的BA對無核葡萄的胚珠發(fā)育有促進(jìn)作用。為打破胚的休眠，可加入適宜濃度的GA和IAA取代低溫處理。誘導(dǎo)分化階段可加入6－BA和NAA。在幼胚生長中，附加碳水化合物如葡萄糖和果糖等，既可提高培養(yǎng)基的滲透壓，還可為胚的發(fā)育提供能量，對胚性生長有利，但后期胚的萌發(fā)需降低滲透壓。切開胚珠可以改善胚與培養(yǎng)基之間的物質(zhì)交流，橫切的胚珠培養(yǎng)萌發(fā)率最高[10]。此外，培養(yǎng)條件的設(shè)置對于胚挽救也有一定的影響。如合適的溫度、適量的光照及培養(yǎng)基適宜的pH值都是胚挽救成功的重要條件。有研究說明，常溫、黑暗比低溫、光照更有利于胚珠的發(fā)育[3]。

4結(jié)語

胚挽救技術(shù)作為一種高效育種技術(shù)，在無核葡萄的品種選育中得到了廣泛地應(yīng)用且進(jìn)展迅速，不僅極大地拓寬了葡萄育種的范圍和效率，更縮短了育種周期，推動了葡萄育種的進(jìn)程。但是，這項技術(shù)還存在較多的不足，如雖然胚挽救技術(shù)較成熟，但葡萄無核性狀的遺傳規(guī)律理論研究較少；應(yīng)用于遠(yuǎn)緣雜交育種，供選群體無核性狀來源少且育種效率低，對不同無核葡萄的基因型還缺乏調(diào)節(jié)機(jī)制研究；對不同葡萄無核品種的適宜接種時期以及幼胚營養(yǎng)水平和培養(yǎng)條件深入研究不夠；無核葡萄育種與常規(guī)有核雜交育種和分子輔助標(biāo)記選擇技術(shù)結(jié)合不緊密等。因此，立足已有的研究基礎(chǔ)，胚挽救技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)將會大大地提高優(yōu)良無核葡萄品種的選育效果，而精確的基因定位技術(shù)和進(jìn)一步完善并充分發(fā)揮無核葡萄胚挽救技術(shù)體系，是今后研究努力的方向。

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