慢性腎小球腎炎動(dòng)物模型制作及其形態(tài)學(xué)的改變

張　暉　周酈楠　張　維　劉永林

在我國北方是慢性腎小球腎炎疾病發(fā)病率較高的地區(qū)，近年來，隨著人民的物質(zhì)生活水平的不斷提高，慢性腎小球腎炎的發(fā)病率占有相當(dāng)大的比重。迄今為止，尚無十分有效的治療，因此，研究其發(fā)病機(jī)制、防治措施具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)建立的動(dòng)物模型可為臨床治療該疾病提供實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜅l件。為臨床研究新藥物提供實(shí)驗(yàn)室可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性Wistar大鼠 中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供；LUZEX-F顯微圖像分析儀（日本，松下公司）；日立H-600透射電鏡；恒冷箱切片機(jī)（日本）。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 本實(shí)驗(yàn)選用雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量260~300 g，隨機(jī)分成3組。

空白對(duì)照組：20只（`10只用于電鏡染色，10只用于電鏡觀察）；慢性腎小球腎炎模型光鏡組：60只；慢性腎小球腎炎模型電鏡組：20只。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 經(jīng)典慢性腎小球腎炎模型制備^[1]①L型菌誘發(fā)選用家兔，急慢性腎小球腎炎患者3 ml血，除去血漿，生理鹽水洗3次，低滲鹽水0．25%處理4 h，0．2 μm微孔濾膜負(fù)壓抽濾，高滲肉湯或牛肉湯培養(yǎng)基與L型菌培養(yǎng)基生長的細(xì)菌收集。健康白兔2~2．5 kg，1000萬左右細(xì)菌耳緣靜脈注入，隔日一次，共8次，30 d后生腎炎;②靜脈注射基底膜血清加脂多糖制基底膜抗原：BALB/c小鼠200只，處死取腎皮質(zhì)，在孔徑105 μm的不銹鋼篩網(wǎng)上輾成勻漿后，用125 μm，75μm濾膜重疊過濾，留存于75 μm濾膜過濾的生理鹽水中漂洗。收集后超聲粉碎低溫離心，沉淀于2 ml生理鹽水；抗血清制備：2 ml抗原加4 ml福氏完全佐劑，多點(diǎn)注射，3、5、6周同樣方法強(qiáng)化，7周測(cè)滴度，1C∶C8時(shí)取血清。血清0．5 ml，（1C∶C4稀釋）小鼠尾靜脈注射，24 h后0．04 mg脂多糖注射；③異種血清法雄性大鼠：福氏完全佐劑1 mg和陽離子化牛血清白蛋白3 mg（C-BSA等電點(diǎn)8．6）背部皮下多點(diǎn)注射為予免疫，兩周后正式免疫；1、2周給C-BSA3 mg，3~4周給C-BSA5 mg，分別用pH704，0．01 mol/LBSA稀釋至1 ml，1次/d，靜脈注入。

1．3．2 實(shí)驗(yàn)組慢性腎小球腎炎模型制備 筆者將經(jīng)典的慢性腎小球腎炎模型簡(jiǎn)化，選用雄性大鼠皮下注射：福氏完全佐劑1 mg和同種大鼠腎組織的勻漿液0．5 ml，1次/d。

1．3．3 光鏡組動(dòng)物模型取材 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉（40 ml/kg）腹腔麻醉后開胸，經(jīng)左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的生理鹽水500 ml，同時(shí)剪開右心耳。繼用0．1M磷酸鹽緩沖液（PBS,pH=7．4）配制的固定液（含4%多聚甲醛）灌流固定。取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦組織，放入含4%多聚甲醛的固定液中進(jìn)行后固定大約2 h，之后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經(jīng)水包埋，恒冷箱連續(xù)橫切片，片厚20 μm。

1．3．4 尼氏染色方法^[2]冰凍切片吹干，經(jīng)PBS漂洗5 min×3次，將切片置入1%甲苯胺藍(lán)溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5 min×3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1．3．5 透射電鏡組模型取材 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠在1%戊巴比妥鈉（40 ml/kg）腹腔麻醉下，經(jīng)左心室灌注含1%肝素鈉的生理 鹽水300 ml快速?zèng)_洗后，用2%多聚甲醛及2．5%戊二醛的0．1 mol磷酸緩沖液250 ml灌流固定，灌流后立即取腎，將組織塊置于4℃，2．5%戊二醛中固定24 h，再經(jīng)1%鋨酸固定1 h后，常規(guī)脫水，包埋，L.K.B超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，日立H-600透射電鏡觀察并拍片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 尼氏染色結(jié)果 在空白對(duì)照組切片中可見腎組織的細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞數(shù)量較多，排列緊密，胞漿內(nèi)尼氏體豐富；而在慢性腎小球腎炎模型光鏡組中可見腎組織受損細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)改變，腫脹或皺縮，細(xì)胞壞死崩解，溶解成碎片。

2．2 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 在空白對(duì)照組切片中可見細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器均為正常；而在慢性腎小球腎炎模型電鏡組中可見受損細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷性改變：核皺縮，核膜部分溶解消失、線粒體腫脹、嵴紊亂甚至缺失、線粒體出現(xiàn)空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；高爾基復(fù)合體擴(kuò)張，突觸數(shù)量減少、前后膜融合、突觸小泡不清或出現(xiàn)聚集。

3 結(jié)論

根據(jù)尼氏染色和透射電鏡結(jié)果證明慢性腎小球腎炎模型制備成功。該模型的制備不僅為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究提供了可靠的動(dòng)物模型，更為藥物臨床治療慢性腎小球腎炎提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。該動(dòng)物模型的建立成功，簡(jiǎn)化了以往經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型的煩瑣，更為簡(jiǎn)捷易操作，不僅節(jié)省實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，更為新藥開展治療慢性腎小球腎炎提供良好的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué).人民軍醫(yī)出版社，2000:473-474.

［2］ 梁曉俐.病理學(xué)基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)技術(shù).軍事醫(yī)學(xué)科技出版社，2004:129-130.