胰島移植現(xiàn)狀及展望

史光軍 陳斌 欒紹海 于江 張磊 許評

·綜述·

胰島移植現(xiàn)狀及展望

史光軍 陳斌 欒紹海 于江 張磊 許評

糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的高發(fā)性的代謝性疾病。臨床分為1型(T1DM)、2型(T2DM)、特殊型、妊娠糖尿病4種類型。目前常用的糖尿病治療方法包括胰島素注射、胰島素泵、全胰腺移植和胰島移植。雖然注射外源性胰島素可以有效控制血糖，但無法改善血糖的生理性代謝和根本解決DM并發(fā)癥的問題。而全胰腺移植和胰島移植均可使受者獲得接近生理狀態(tài)的胰島素分泌。與全胰腺移植相比，胰島移植手術(shù)簡單、安全、并發(fā)癥少,可糾正糖代謝紊亂，尤為重要的是可以防止、減緩甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病性微血管病變,減少心、腎等臟器并發(fā)癥的發(fā)生,降低病死率。近些年來,隨著胰島分離純化技術(shù)提高、新型免疫抑制劑問世等,胰島移植已從實驗階段進(jìn)入了臨床實踐,取得了令人鼓舞的效果。

一、胰島細(xì)胞移植技術(shù)發(fā)展史

1894年,英國醫(yī)師Williams 采用部分羊胰腺成分移植治療臨床糖尿病，開創(chuàng)了胰島移植的歷史。1967年Lacy等[1]采用消化酶從大鼠胰腺中分離出完整胰島，開展了人類首例異種胰島移植。1972年Ballinger等[2]報道大鼠異體胰島移植實驗獲得成功。1980年Agren等采用胚胎胰島或胚胎胰組織移植于人類,獲得了短期胰島素分泌功能,部分患者甚至撤除了外源性胰島素。1989年Ricordi等報道了胰腺消化自動化操作方法，稱之Ricordi方法,并廣泛應(yīng)用于實驗研究與臨床研究。1990年Scharp等采用胰島細(xì)胞移植治療T1DM后,患者撤除胰島素達(dá) 1個月之久。從那時起,不論移植后用什么免疫抑制方案，大多數(shù)使用1個胰腺分離的胰島進(jìn)行移植的患者都只有短期甚至沒有脫離胰島素。2000年加拿大Edmonton Alberta大學(xué)的Shapiro領(lǐng)導(dǎo)的研究小組探索了一種胰島移植方案——Edmonton方案。他們對 7 例有嚴(yán)重低血糖史和代謝不穩(wěn)定的 T1DM患者使用2～4個胰腺進(jìn)行分離、多次移植，并調(diào)整免疫抑制方案，術(shù)后平均隨訪11.9個月,均不需胰島素治療,未再發(fā)生嚴(yán)重低血糖。此后,世界范圍內(nèi)再次掀起了成人胰島細(xì)胞移植的研究熱潮。2000年至今,全世界有15個國家47個機(jī)構(gòu)開展該項研究[3]。目前，國內(nèi)多家醫(yī)院開展了胰島移植，如南京軍區(qū)福州總醫(yī)院和上海市第一人民醫(yī)院開展成人胰島細(xì)胞移植(其中3例與腎臟聯(lián)合移植),哈爾濱開展了1例成人胰島與胚胎胰組織混合移植,無錫開展了1例肝臟移植與未純化成人胰島組織聯(lián)合移植,長沙開展了豬胰島異種移植等。

二、胰島的分離純化

胰島分離純化方法很多,一般采用膠原酶灌注-連續(xù)密度梯度法分離胰島。將尸體胰腺經(jīng)腹主動脈灌注4℃的UW液后切取胰腺,置0℃的UW液中保存。在無菌條件下切取胰體尾部(因胰體尾部含大量胰島且膽汁污染機(jī)會少),經(jīng)主胰管灌注膠原酶。通過機(jī)械擴(kuò)張和酶的消化將胰島組織分離出來,然后移入全自動細(xì)胞分離機(jī)分離純化胰島,在體外嚴(yán)格篩查和鑒定,進(jìn)一步離析雜質(zhì),達(dá)到純化的目的[4]。分離純化后的胰島采用雙硫腙 (DTZ) 染色法檢測胰島純度,用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。原位整體灌注法獲得的細(xì)胞團(tuán)塊較多,單細(xì)胞較少,移植效果好。

近來德國Bucher等[5]研制出一種用于成人胰島分離的新型消化酶,稱為 Serva膠元酶NB1,胰島獲得率與以前使用的釋放酶類似,但胰島的形態(tài)學(xué)得到改善,細(xì)胞凋亡比例減少,且無批號間酶活性變異,有望成為人胰島分離的專用消化酶。Huang等[6]使用UW液配制Euro-Ficoll的連續(xù)密度梯度離心法純化胰島,可進(jìn)一步提高胰島的純度至95%以上,胰島的收獲量由每次分離218 000個提高到435 318,胰島細(xì)胞活力由65.4%上升到92.1%。一些中心改進(jìn)了胰腺保存、分離培養(yǎng)技術(shù),結(jié)合新型免疫抑制方案如抗CD3抗體,使最初Edmonton方案中平均2個供胰供給1個受者,每個受者平均接受 2次移植,進(jìn)步到單個供胰、單次移植[7-8]。

三、胰島移植

理想的胰島移植部位的選擇應(yīng)兼顧以下3方面：①手術(shù)安全、簡單；②有利于維持代謝穩(wěn)定；③免疫耐受。經(jīng)門靜脈肝內(nèi)移植曾被認(rèn)為是較理想的部位,但后來人們發(fā)現(xiàn),胰島會隨門靜脈血流丟失,口服藥物也會影響肝內(nèi)胰島的功能,不純的胰島移植物還可導(dǎo)致肝內(nèi)靜脈栓塞。目前國內(nèi)外臨床移植最常用的部位以腹腔內(nèi)及肌肉內(nèi)最多[9],主要包括三角肌、腹直肌、小網(wǎng)膜內(nèi)、門靜脈內(nèi)、體靜脈內(nèi)和腎脂肪囊內(nèi)等,較少見的有顱內(nèi)移植。肌肉內(nèi)移植方便、安全、創(chuàng)傷小,但肌肉不是免疫耐受區(qū),影響長期療效。小網(wǎng)膜因血供團(tuán)(ICC)豐富、寬敞、外科手術(shù)簡便安全,胰島素釋放至門靜脈系統(tǒng)符合胰島分泌途徑等特點,應(yīng)該是理想的移植部位。腎包膜下、顱內(nèi)、睪丸是體內(nèi)的免疫耐受區(qū),此處移植胰島可能避免移植排斥。

有研究估計，超過三分之二的移植胰島在移植后早期即被破壞。移植胰島在新生血管形成前兩周的缺氧應(yīng)激是最主要的損傷機(jī)制,其他的影響因素還包括組織因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和血小板激活、移植部位的炎癥因子釋放和激活、免疫排斥反應(yīng)介導(dǎo)的損傷等。為提高臨床胰島移植的效果，針對胰島細(xì)胞凋亡進(jìn)行了一些干預(yù)研究，如抑制凝血酶和組織因子可以減少胰島細(xì)胞凋亡。也有很多研究在尋找可以促進(jìn)胰島細(xì)胞生長的因子或細(xì)胞分子以提高移植胰島的存活和功能，如在嚙齒類動物模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子(HGF)可以促進(jìn)移植胰島的存活和功能,可以節(jié)約胰島,但HGF半衰期極短,需要持續(xù)靜脈滴注。轉(zhuǎn)基因小鼠在HGF表達(dá)增加的同時伴有其他部位組織的腫瘤發(fā)生增加,在人胰島移植中的作用及長期安全性的研究無疑存在轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及倫理學(xué)方面的障礙[10]。

四、胰島移植類型

1．同種異體移植：同種異體胰腺的胰島是提供臨床胰島移植的主要來源。腦死亡供體的成人胰腺可供分離的胰島較多,分泌胰島素穩(wěn)定,但胰島免疫原性強(qiáng),耐免疫排斥差,需終生采用免疫抑制。死嬰胎胰島免疫源性弱,增殖力強(qiáng),但胎胰島含量少,數(shù)個供體方能滿足一個受體需要。這些來源的胰島遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床移植的需要。

2．活體移植：由于胰腺手術(shù)并發(fā)癥多且嚴(yán)重而且供者將胰腺部分供出后要承受患糖尿病的風(fēng)險,為此這一直是胰腺或者是胰島活體移植的禁區(qū)。但在2004年,日本Matsumoto等[11]首先比較了胰頭及胰尾部胰島細(xì)胞活力及產(chǎn)量的差異,結(jié)果認(rèn)為胰尾部胰島細(xì)胞適合做活體移植。2005年他們進(jìn)行了第 1例活體胰島移植[12]。從供者胰腺中共分離出胰島408 144 IEQ,未經(jīng)純化立即移植入受者體內(nèi) ,移植后22 d受者不依賴胰島素注射,37 d后口服葡萄糖耐量試驗陰性,供體術(shù)后血糖保持穩(wěn)定。但在這個報道中受者為慢性胰腺炎患者,而不是自身免疫性的1型糖尿病患者?；铙w供者來源的胰腺與尸體胰腺相比具有以下優(yōu)勢：①不會產(chǎn)生細(xì)胞因子釋放綜合征；②胰腺組織的損傷較?。虎廴粢认賮碓从谙嚓P(guān)供者，則組織相容性好[13]；④縮短了熱缺血和冷缺血時間,可以獲得更多更高質(zhì)量的胰島細(xì)胞。但活體胰島移植供、受者的長期療效如何目前尚不得而知，而且供者存在一定的風(fēng)險，必須謹(jǐn)慎選擇。

3．異種移植：由于同種胰島細(xì)胞來源短缺，想方設(shè)法增加胰島供體來源是當(dāng)前追求的目標(biāo)，利用動物的胰島細(xì)胞是可能取得突破的途徑之一。異種移植不僅存在免疫排斥反應(yīng),這可以采用微囊化等技術(shù)加以解決，更重要的是動物體內(nèi)存在尚不為人類知道的病原體,這些病原體在移植后不知是否能導(dǎo)致嚴(yán)重后果。豬胰島素與人胰島素的氨基酸序列僅有一個氨基酸不同，應(yīng)是臨床胰島移植的最佳異種供體之一。1998年 Heneine等[14]報道了 10例患者接受豬胰島細(xì)胞異種移植后未能檢測到致命病毒的存在依據(jù)。為此我們有可能利用異種供體特別是豬作為異種供者?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)在異種胰島細(xì)胞移植中的應(yīng)用更使異種胰島細(xì)胞移植具有令人鼓舞的前景[14-16]。

4．干細(xì)胞移植：胰島干細(xì)胞理論上可以取之不盡且可以進(jìn)行免疫修飾等處理，是最理想的胰島來源。最近研究者發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、脾干細(xì)胞、胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞等在一定條件誘導(dǎo)下可分化為分泌胰島素的胰島樣細(xì)胞,移植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)可以逆轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)并保持血糖穩(wěn)定。胚胎干細(xì)胞作為最有前景的胰島細(xì)胞替代治療途徑是近年來的研究熱點，但目前對其分化為胰島細(xì)胞的過程及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚,誘導(dǎo)分化過程難于控制,誘導(dǎo)的細(xì)胞中胰島細(xì)胞比例較低,分泌的激素種類( 如胰高血糖素、生長抑素等) 也較多 ,而且存在致腫瘤的危險,在一些國家還存在倫理學(xué)爭論。近年來發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞可以從自體切除的胰腺( 胰腺導(dǎo)管壁干細(xì)胞和胰島) 或肌干細(xì)胞分離出來,在一定誘導(dǎo)方式下向胰島細(xì)胞方向發(fā)展。它所形成的移植物是自體移植物,可以不應(yīng)用免疫干預(yù)。如果能夠達(dá)到有效的誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)與提取,恰當(dāng)?shù)囊浦膊课?合理的促移植物血管新生的方法,將會達(dá)到長期發(fā)揮功能,永久性脫離外源性胰島素的效果。但胰島干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化同時，細(xì)胞過度增殖的潛在可能性是學(xué)界擔(dān)憂的問題[17]。

五、胰島移植免疫抑制及免疫隔離

胰島移植與其他器官如肝、腎移植的一個顯著不同點在于移植目的不同。1型糖尿病患者接受胰島移植的目的在于改善血糖控制、提高生活質(zhì)量而不是救命,因此對免疫抑制劑不良作用的耐受也比其他器官移植要差,部分患者甚至因嚴(yán)重不良反應(yīng)而停用免疫抑制劑,這在其他器官移植中是非常罕見的。

應(yīng)用皮質(zhì)類固醇激素是器官移植的傳統(tǒng)方法,但對胰島素具有抵抗作用,有明顯的胰島毒性,是影響胰島移植物存活和功能的重要因素之一[18]。Edmonton方案采用無糖皮質(zhì)激素、低劑量的FK506(鈣調(diào)磷酸酶抑制劑)、雷帕霉素及抗CD25單克隆抗體等取得較好的效果,雖有一定不良作用,結(jié)果顯示其不失為胰島無毒或低毒性優(yōu)化的免疫誘導(dǎo)與抑制方案。在新的免疫抑制方案中,最值得關(guān)注的是FTY720[19]。該藥無誘發(fā)糖尿病的不良反應(yīng),無腎毒性,并有助于胰島細(xì)胞的擴(kuò)增。西羅莫司是 Edmonton方案中首次被引入的新型免疫抑制劑，可以在體內(nèi)和體外促進(jìn)胰島素的分泌,并能減少細(xì)胞的凋亡[20]。但由于它也可抑制血管內(nèi)皮生長因子,故可能并不利于胰島的長期存活[21]。最近報道的CTLA4-Ig突變分子-LEA29Y是一種新型的免疫抑制劑,LEA29Y的結(jié)構(gòu)與CTLA4-Ig類似,但其與 B7-1和B7-2分子的結(jié)合活性更高。在靈長類動物的同種腎移植和胰島移植模型中的結(jié)果表明,LEA29Y免疫抑制效果較CTLA4-Ig更好，而且與常規(guī)的免疫抑制劑有協(xié)同作用。Kirk等[22]應(yīng)用人源化的抗 B7分子也得到了類似的效果。為此 Shapiro等[23]認(rèn)為，LEA29Y及FTY720這兩種新型免疫抑制劑將會取代目前我們所使用的免疫方案。

胰島移植的免疫隔離是利用人工裝置將胰島同受者免疫系統(tǒng)隔離，包括微囊包被、半透膜技術(shù)或?qū)⒁葝u植入腦內(nèi)、胸腺、睪丸等免疫耐受區(qū)域。

六、胰島移植的展望

近年來胰島細(xì)胞移植治療1型糖尿病的研究取得了長足的進(jìn)展,它具有穩(wěn)定病情、減少外源性胰島素的用量、防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與進(jìn)展、提高生活質(zhì)量等優(yōu)點,并有成為糖尿病最終治療方案的趨勢,但它尚有一定的局限性：①胰島細(xì)胞來源不足；②胰島細(xì)胞的分離與純化技術(shù)的復(fù)雜性；③移植后的免疫排斥反應(yīng)以及隨時間而呈現(xiàn)出的移植物功能衰退；④胰島移植的成功率低；⑤成人胰島細(xì)胞移植的長期效果尚難確定。

雖然胰島移植仍存在很多困難和爭議,道路仍會很艱辛,但胰島細(xì)胞移植治療糖尿病已經(jīng)顯示了巨大的臨床價值和前景。隨著技術(shù)的進(jìn)步和新型低毒乃至無毒免疫抑制方案的建立,相信胰島移植會發(fā)展成為理想的根治糖尿病的方法 ,使更多的患者受益。

[1] Lacy PE,Kostianovsky M.Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.Diabetes,1967,16:35.

[2] Ballinger W,Lacy P.Transplantation of intact pancreatic islets in rats.Surgery,1972,72:175.

[3] Bretzel RG,Schultz AO,Hering BJ,et al.Update of the international islet transplant registry∥Abstract of 1st International Summit Symposium on Adult Islet Transplantation in China.2006:4.

[4] Bugliani M,Lupi R,Del Guerra S,et al.An alternative and simple method to consistenily prepare viable isolated human islets for clinical transplantation J.Transplant Proc,2004,363:605-606.

[5] Bucher P,Mathe Z,Morel P,et al.Assessment of a novel two-component enzyme preparation for human islet isolation and transplantation.Transplantation,2005,79:91-97.

[6] Huang GC,Zhao M,Jones P,et al.The development of new density gradient media for purifying human islets and islet- quality assessments.Transplantation,2004,77:143-145.

[7] Hering BJ,Kandaswamy R,Harmon JV,et al.Transplantation of cultured islets from two-layer preserved pancreases in type 1 diabetes with anti- CD3 antibody.Am J Transplant,2004,4:390-401.

[8] Hering BJ,Kandaswamy R,Ansite JD,et al.Single-donor,marginal-dose islet transplantation in patients with type 1 diabetes.JAMA,2005,293:830-835.

[9] 樸松山,李香俊,金鶴萬,等.經(jīng)門靜脈肝內(nèi)胰島細(xì)胞移植.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報,1998,21:223.

[10] Fiaschi-Taesch N,Stewart AF,Garcia-Ocaa A.Improving islet transplantation by gene delivery of hepatocyte growth factor(HGF) and its down stream target,protein kinase B(PKB)/Akt.Cell Biochem Biophys,2007,48:191-199.

[11] Matsumoto S,Tanaka K,Strong DM,et al.Efficacyof human islet isolation from the tail section of the pancreas for the possibility of living donor islet transplantation.Transplantation,2004,78:839 -843.

[12] Matsumoto S,Tanaka K.Pancreatic islet cell transplantation using non-heart-beating donors(NHBDS).J Hepatobiliary Pancreat Surg,2005,12:227

[13] Amiel SA,Rela M.Live organ-donation for islet transplantation.Lancet,2005,365:1603-1604.

[14] HeneineW,Tibell A,Switzer WM,et al.No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus in recipientsof porcine islet-cell xenografts.Lancet,1998,352:695-699.

[15] Rao P,Roccisana J,Takane KK,et al.Gene transfer of constitutively active Aktmarkedly improves human islet transplant outcomes in diabetic severe combined immunodeficient mice.Diabetes,2005,54:1664-1675.

[16] Contreras JL,Xie D,Mays J,et al.A novel approach to xenotransplantation combining surface engineering and genetic modification of isolated adultporcine islets.Surgery,2004,136:537 -547.

[17] Ryan EA,Paty BW,Senior PA,et al.Five-year follow-up after clinical islet trasplantation.Diabetes,2005,54:2060-2069.

[18] Paty BW,Harmon JS,Marsh CL,et al.Inhibitory effects of immunosuppressive drugson insulin secretion from HIT-T15 cells and Wistar rat islets.Trans plantation,2002,73:353-357.

[19] Truong W,Emamaullee JA,Merani S,et al.Human islet function is not impaired by the sphingosine-1-phosphate receptor modulator FTY720.Am J Transplant,2007,7:2031-2038.

[20] Marcelli-Tourvieille S,Hubert T,Moerman E,et al.In vivo and in vitro effect of sirolimus on insulin secretion.Transplantation,2007,83:532-538.

[21] Cross SE,Richards SK,Clark A,et al.Vascular endothelial growth factor as a survival factor for human islets:effect of immuno-suppressive drugs.Diabetologia,2007,50:1423-1432.

[22] Kirk AD,Tadaki DK,Celniker A,et al.Induction therapy with monoclonal antibodies specific for CD80 and CD86 delays the onset of acute renal allograft rejection in non-human primates.Transplantation,2001,72:377-784.

[23] Shapiro AM,Lakey JR,Paty BW,et al.Strategic opportunities inclinical islet transplantation.Transplantation,2005,79:1304-1307.

2009-02-27)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.026

266071 山東青島，青島市市立醫(yī)院 肝膽胰外科