組織工程膀胱的血管化及其策略

楊 斌 戴玉田 孫則禹

組織工程膀胱的血管化及其策略

楊 斌 戴玉田 孫則禹

一些先天性的疾?。ㄈ绨螂淄夥┗蜓装Y、感染、腫瘤以及創(chuàng)傷等可引起膀胱結(jié)構(gòu)和功能的缺失或損害，常常需要一定的組織或材料進(jìn)行膀胱的修復(fù)和重建[1]。在探索膀胱修復(fù)和重建的歷史上，筋膜、膀胱粘膜下層、大網(wǎng)膜、小腸粘膜下層、合成材料等都由于生物相容性、機(jī)械力學(xué)性能以及植入物萎縮、纖維化、結(jié)石形成等并發(fā)癥而宣告失敗。迄今為止，利用腸道進(jìn)行膀胱的修復(fù)和重建仍是進(jìn)行膀胱替代的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。但是，由于腸道處在泌尿系的環(huán)境中，可能會(huì)引起代謝紊亂、感染、結(jié)石形成甚至惡變等一系列并發(fā)癥[3-4]。因此，探尋合理的膀胱替代物是醫(yī)學(xué)界的一項(xiàng)挑戰(zhàn)，而組織工程技術(shù)提供了新的思路和方法[2，5]。

1 組織工程膀胱研究的基本原理

組織工程膀胱研究的基本思路是，在體外大規(guī)模擴(kuò)增膀胱種子細(xì)胞，再將其種植到支架材料上，在體外構(gòu)建組織工程膀胱壁，然后植入體內(nèi)以進(jìn)行膀胱修復(fù)和重建。組織工程膀胱構(gòu)建需要具備3個(gè)要素：支架材料，種子細(xì)胞和植入體內(nèi)后建立血液循環(huán)以供給細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育所需的物質(zhì)并帶走代謝產(chǎn)物。支架材料要求具有良好生物相容性、生物可降解性，并支持種子細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)以及發(fā)育等[6]。種子細(xì)胞主要是尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。研究顯示，尿路上皮細(xì)胞再生能力較強(qiáng)，而平滑肌細(xì)胞再生能力則較差[7]。因此，組織工程膀胱構(gòu)建的關(guān)鍵在于構(gòu)建結(jié)構(gòu)和功能良好的平滑肌組織。

2 血管新生和血管發(fā)生的機(jī)制

新生血管形成（Neovasculogenesis）包括血管發(fā)生（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）。血管發(fā)生是指內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞即內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cell）在血管生長(zhǎng)的原位增殖、遷移、分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞并形成血管的過(guò)程。血管新生是指在已經(jīng)存在的血管上以出芽方式形成新的血管的過(guò)程，即通過(guò)成熟內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖來(lái)形成新的血管[8]。以往認(rèn)為，血管新生是出生后血管生長(zhǎng)的唯一機(jī)制，但隨著近年來(lái)外周血中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞，認(rèn)識(shí)到血管發(fā)生不僅存在于胚胎時(shí)期，也是出生后新生血管形成的機(jī)制之一[9]。新生血管形成是血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、促血管生成的因子、細(xì)胞外基質(zhì)等相互作用，共同完成的一系列過(guò)程。

新生血管形成參與了重要的生理過(guò)程，如在創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)中，新生血管形成后，為病損區(qū)域供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，支持組織再生[10]。近年來(lái)，新生血管形成在治療缺血性疾病的研究和應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用。研究發(fā)現(xiàn)，治療性血管新生/血管發(fā)生能夠明顯改善心肌梗死和糖尿病肢體缺血患者缺血區(qū)的血液循環(huán)，改善組織和器官的功能[11-12]。利用新生血管形成的原理進(jìn)行組織工程領(lǐng)域的人工組織血管化的研究也取得了極大進(jìn)展[13]。

3 組織工程血管化研究的模型

組織工程血管化研究的模型主要有體外模型和體內(nèi)模型。體外模型主要將組織工程組織在體外進(jìn)行預(yù)血管化，研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞參與預(yù)血管化的效應(yīng)和各種生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)作用，揭示其中的分子機(jī)制[14]。體內(nèi)模型主要研究植入組織在體內(nèi)的血管化過(guò)程及其機(jī)制，主要包括植入物與宿主的相互作用、促血管化效應(yīng)和生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)作用，常見(jiàn)的體內(nèi)模型有角膜小袋模型、雞胚絨毛膜尿囊模型、基質(zhì)膠體內(nèi)填塞模型、海綿基質(zhì)體內(nèi)植入模型以及腸系膜血管新生模型和小鼠背部皮下室模型[15]。2005年，Levenberg等[16]分別在體外模型和體內(nèi)模型進(jìn)行了骨骼肌組織的血管化研究。研究中將人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、鼠成肌細(xì)胞種植于體外合成的三維多孔支架材料上，體外培養(yǎng)后進(jìn)行組織學(xué)觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)有微血管網(wǎng)絡(luò)形成，在培養(yǎng)基中加入VEGF、PDGF-BB及鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，能增強(qiáng)體外預(yù)血管化效應(yīng)。在體內(nèi)模型中，將這種體外預(yù)血管化的肌組織種植入免疫缺失的大鼠背部皮下，發(fā)現(xiàn)體外形成的微血管網(wǎng)絡(luò)與宿主的微血管建立吻合，形成有循環(huán)功能的血管系統(tǒng)，供應(yīng)肌組織的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

4 組織工程膀胱血管化的策略

在體外，接種到支架材料上用于構(gòu)建組織工程膀胱的種子細(xì)胞能夠從培養(yǎng)基中獲取營(yíng)養(yǎng)；而植入體內(nèi)早期，植入組織僅能依靠周?chē)?00-200 μm的距離范圍內(nèi)）血液的擴(kuò)散效應(yīng)而獲得代謝所需的物質(zhì)，另外，宿主自身血管向植入組織長(zhǎng)入的過(guò)程是極其緩慢且作用十分有限[13，17-18]。大面積的較厚的平滑肌組織，則會(huì)由于缺血、缺氧導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡，最終會(huì)影響平滑肌的發(fā)育并導(dǎo)致替代組織的功能障礙。因此，促進(jìn)體外構(gòu)建的膀胱組織植入體內(nèi)后的快速血管化是目前組織工程膀胱面臨的主要問(wèn)題[19]。近年來(lái)，眾多學(xué)者在該領(lǐng)域進(jìn)行了積極探索，也取得了一定的進(jìn)展。

4.1 支架材料的優(yōu)化設(shè)計(jì)：血管化的先決條件

組織工程膀胱血管化的研究和應(yīng)用首先需要選擇合適的支架材料，影響組織血管化的支架材料的參數(shù)有支架材料的成分、表面特征、孔徑、和孔隙率[6，20]。因此，對(duì)支架材料進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，能為促進(jìn)組織工程膀胱的血管化提供先決條件。研究表明，在PGA中加入膠原成分能夠明顯促進(jìn)組織工程膀胱在擴(kuò)大成形術(shù)后的功能恢復(fù)，這可能是因?yàn)橹Ъ懿牧现械哪z原成分促進(jìn)了組織工程膀胱的血管化，快速地建立了血液循環(huán)[2]。還有研究顯示，對(duì)PLGA的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行納米修飾后能夠明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞和膀胱平滑肌細(xì)胞的密度[21－22]；進(jìn)一步研究表明，該支架材料能夠明顯增強(qiáng)膀胱平滑肌細(xì)胞的黏附、增殖，促進(jìn)彈力蛋白、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，增強(qiáng)膀胱平滑肌細(xì)胞的功能[23-24]。支架材料的孔徑越大，孔隙率越高，血管化則越充分。因此，在制備無(wú)細(xì)胞基質(zhì)作為支架材料時(shí)，增大孔徑，提高孔隙率，可能會(huì)促進(jìn)組織工程膀胱的血管化[25]。

4.2 復(fù)合生長(zhǎng)因子：促進(jìn)組織工程膀胱血管化

利用促進(jìn)血管新生的生長(zhǎng)因子（如VEGF，bFGF，PDGF家族等）能促使宿主自身血管快速長(zhǎng)入植入組織，為組織工程膀胱體內(nèi)充分快速血管化提供了另一種選擇。生長(zhǎng)因子通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖而促進(jìn)血管新生，還可能通過(guò)動(dòng)員宿主內(nèi)皮祖細(xì)胞而發(fā)揮作用[26]。

有兩種方法可以將生長(zhǎng)因子復(fù)合到組織工程膀胱，生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是促使植入組織局部生長(zhǎng)因子高濃度表達(dá)的手段之一，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)植入部位VEGF、PDGF-BB等生長(zhǎng)因子的高表達(dá)，并促進(jìn)血管新生和組織再生[27－28]。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者利用VEGF基因轉(zhuǎn)染膀胱平滑肌細(xì)胞，使VEGF在局部高效表達(dá)而促進(jìn)組織工程膀胱快速血管化；還有學(xué)者利用VEGF基因轉(zhuǎn)染膀胱尿路上皮細(xì)胞，以促進(jìn)組織工程尿道的血管化[29]。然而，基因水平上對(duì)蛋白表達(dá)的調(diào)控難以掌控，生長(zhǎng)因子持續(xù)的過(guò)量表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。組織工程膀胱植入體內(nèi)后，只需要生長(zhǎng)因子在短期內(nèi)的局部高表達(dá)，在血液循環(huán)建立后，則不再需要生長(zhǎng)因子持續(xù)的高表達(dá)。因此，在植入組織局部直接包埋生長(zhǎng)因子蛋白并使其持續(xù)釋放，是促進(jìn)組織工程膀胱快速血管化的最佳選擇，這種方案給予宿主的是生長(zhǎng)因子蛋白，比轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)因子基因更安全[18]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，將膀胱無(wú)細(xì)胞基質(zhì)（BAM）在體外與bFGF、PDGF-BB、VEGF等生長(zhǎng)因子孵育后，生長(zhǎng)因子能夠復(fù)合到脫細(xì)胞基質(zhì)支架中，再將該支架材料植入小鼠體內(nèi)，脫細(xì)胞基質(zhì)中的膠原成分能保護(hù)生長(zhǎng)因子免受體內(nèi)蛋白水解酶的降解。隨著支架材料的降解，生長(zhǎng)因子能持續(xù)釋放達(dá)2周[30]。研究發(fā)現(xiàn)，利用BAM體外復(fù)合VEGF、bFGF后再行膀胱替代，能促進(jìn)替代組織的血管新生，并促進(jìn)平滑肌組織的生長(zhǎng)和發(fā)育，改善膀胱功能[31－32]。

4.3 接種血管內(nèi)皮細(xì)胞：提供血管壁細(xì)胞成分

促進(jìn)組織工程膀胱快速血管化的另一方法，就是利用內(nèi)皮細(xì)胞將構(gòu)建的組織工程膀胱進(jìn)行預(yù)血管化，在植入體內(nèi)后使其與宿主本身血管吻合，從而迅速建立血液循環(huán)[17]。利用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行組織工程膀胱預(yù)血管化涉及到內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源、內(nèi)皮細(xì)胞和支架材料的相互作用、內(nèi)皮細(xì)胞和種子細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)、血管的發(fā)育成熟以及預(yù)血管化中的各種調(diào)節(jié)因素等復(fù)雜問(wèn)題。

研究證實(shí)，將內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞體外共培養(yǎng)時(shí)，平滑肌細(xì)胞的VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB和TGF-β的mRNA表達(dá)水平明顯升高，bFGF及其受體的mRNA表達(dá)水平降低；PDGF-BB和TGF-β蛋白水平明顯升高；內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平也升高。該研究提示我們，將內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)能促進(jìn)相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)[33]。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)所表達(dá)的PDGF-BB、TGF-β等生長(zhǎng)因子還通過(guò)介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)新生血管穩(wěn)定，發(fā)育成熟[10，34]。因此，利用內(nèi)皮細(xì)胞和膀胱平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，不僅可以對(duì)肌組織進(jìn)行預(yù)血管化，而且還能夠促進(jìn)新生血管的發(fā)育與成熟[35]。

內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源大致可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)是成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，如臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、成人外周血管內(nèi)皮細(xì)胞。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源廣、易培養(yǎng)、增殖能力強(qiáng)。Levenberg等[16]利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)組織工程構(gòu)建的肌組織進(jìn)行預(yù)血管化。但是，成熟內(nèi)皮細(xì)胞也存在不足之處，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞還存在異種或同種異體移植時(shí)的免疫排斥反應(yīng)，成人外周血管的內(nèi)皮細(xì)胞取材較困難，增殖能力欠佳[36]。

另一類(lèi)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，即內(nèi)皮祖細(xì)胞。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在功能和形態(tài)方面不同于成熟內(nèi)皮細(xì)胞。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并具有很強(qiáng)的增殖潛能，同時(shí)還分泌促進(jìn)血管新生的生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)新生血管的形成，這被認(rèn)為是出生后“從無(wú)到有”的新生血管形成過(guò)程。內(nèi)皮祖細(xì)胞在治療性血管新生領(lǐng)域已經(jīng)顯示出極大的研究和臨床應(yīng)用價(jià)值，能夠明顯促進(jìn)糖尿病所致的肢體缺血區(qū)和心肌梗死區(qū)的新生血管形成，改善缺血區(qū)的血液供應(yīng)和組織、器官的功能[9，11，36]。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者將內(nèi)皮祖細(xì)胞用于組織工程皮膚血管化的研究[37]。另外，內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅存在于臍帶血，還存在于骨髓和外周血，這為利用自體的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行組織工程膀胱的血管化提供了可能，并且能夠避免免疫排斥反應(yīng)。

4.4 制備帶血管蒂的無(wú)細(xì)胞基質(zhì)支架

帶血管蒂的移植物在修復(fù)重建的治療中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。Schultheiss等[38]將帶血管蒂的腸管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，在脫細(xì)胞腸管上種植平滑肌細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞構(gòu)建組織工程膀胱壁，再利用內(nèi)皮祖細(xì)胞將脫細(xì)胞的動(dòng)靜脈蒂進(jìn)行內(nèi)皮化，成功構(gòu)建帶有血管蒂的膀胱組織并將血管蒂的動(dòng)靜脈分別與髂外動(dòng)靜脈進(jìn)行端側(cè)吻合。術(shù)后1～3 h，植入組織血流通暢，無(wú)血栓形成；而未種植內(nèi)皮祖細(xì)胞的膀胱組織則在30 min內(nèi)觀(guān)察到血栓形成，血流停滯。

4.5 利用體內(nèi)富含血管網(wǎng)的組織

將體外構(gòu)建的組織植入體內(nèi)時(shí)，用富含血管網(wǎng)的組織包裹，啟動(dòng)炎癥性的創(chuàng)傷-愈合應(yīng)答，同時(shí)由于缺氧而導(dǎo)致內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的釋放，可促進(jìn)植入物周?chē)乃拗餮軆?nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖，長(zhǎng)入植入組織而使植入組織血管化[18]。大網(wǎng)膜是富含血管網(wǎng)的組織，以往的研究表明，預(yù)先將膠原海綿包裹在豬的大網(wǎng)膜內(nèi)一周，使其預(yù)血管化，然后用于膀胱替代，能促進(jìn)膀胱再生[39]。臨床實(shí)驗(yàn)也表明，在行膀胱擴(kuò)大成形術(shù)時(shí)，利用大網(wǎng)膜包裹組織工程膀胱，術(shù)后能夠明顯改善膀胱功能，膀胱容量、膀胱充盈最大壓力、膀胱順應(yīng)性比不用大網(wǎng)膜包裹改善明顯[2]。但是這種依靠刺激宿主血管長(zhǎng)入的過(guò)程較漫長(zhǎng)，其血管化效應(yīng)還需進(jìn)一步研究。

5 組織工程膀胱血管化的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)研究中，體外觀(guān)察血管化效應(yīng)往往是取出植入物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)完成的；而如何進(jìn)行組織工程膀胱血管化的體內(nèi)監(jiān)測(cè)，是組織工程膀胱研究和應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題。

組織工程膀胱血管化的監(jiān)測(cè)應(yīng)遵循監(jiān)測(cè)靈敏、無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射、可定量、低成本、操作方便等原則。激光多普勒具有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、靈敏度高、易操作、無(wú)特殊禁忌癥、可重復(fù)性強(qiáng)和無(wú)放射性損傷等優(yōu)點(diǎn)。因此，在組織工程血管化研究中，激光多普勒技術(shù)在體進(jìn)行植入組織的血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)具有較強(qiáng)實(shí)用性[40]。動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振技術(shù)，因其具有獨(dú)體的捕捉組織及其新陳代謝能力，可反應(yīng)微血管情況及毛細(xì)血管灌流情況，用以評(píng)估局部組織活力和功能，可以對(duì)組織工程膀胱血管化的微血管密度，平均微血管面積進(jìn)行監(jiān)測(cè)[41－42]。此技術(shù)無(wú)離子放射，具有較高的空間分辨率，且能進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能評(píng)價(jià)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

6 結(jié)語(yǔ)和展望

組織工程膀胱可預(yù)制成形，克服處于泌尿系而引起的不利，極具應(yīng)用前景。但是組織工程膀胱的血管化仍是亟待解決的問(wèn)題，需要進(jìn)一步明確新生血管形成機(jī)制。進(jìn)一步發(fā)展組織工程膀胱血管化策略，聯(lián)合應(yīng)用多種促血管化方法，以協(xié)同促進(jìn)組織工程膀胱血管化的實(shí)現(xiàn)。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）－01－0052－04

2008年8月6日；

2008年9月11日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.016

210008江蘇省南京市南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科。