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    BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌的相關(guān)性

    2009-01-30 07:45:48吳劍秋張莉莉馬大偉
    中國腫瘤外科雜志 2009年4期
    關(guān)鍵詞:甲基化良性基因組

    吳劍秋, 張莉莉, 馬大偉

    乳腺癌特異基因(breast cancer specific gene 1,BCSG1)又名SNCG(γ-synuclein gene),是1997年用cDNA 直接測序法發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因[1-4]。已有的研究表明BCSG1在正常乳腺組織中低表達, 在乳腺癌組織中高表達,在乳腺癌的預(yù)后判斷和抗腫瘤藥物篩選中有重要作用[ 5-8]。Pan等[9-12]首先報道 BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其在正常乳腺組織中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài),而在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高去甲基化狀態(tài),同時其異常去甲基化是其在乳腺癌中異常高表達的重要機制之一。但DNA甲基化可受遺傳背景、環(huán)境因素等諸多因素的影響,在不同種族人群中,同一基因的甲基化狀態(tài)及其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用可能存在較大差異[13-16]。關(guān)于中國人群乳腺癌患者中BCSG1甲基化與乳腺癌的關(guān)系,目前尚無定論。本研究擬通過一定樣本量的觀察,探討在中國人群乳腺癌患者中,BCSG1甲基化在乳腺癌發(fā)病及良性增生或纖維腺瘤中的作用。探討位于BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系以及BCSG1甲基化作為乳腺癌分子標志物的可能性。

    1 材料與方法

    1.1 研究材料

    江蘇省腫瘤醫(yī)院2007—2008年經(jīng)手術(shù)切除的具有完整臨床病理資料的乳腺組織標本,獲取新鮮標本后迅速凍存于液氮,然后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中保存。其中乳腺癌及對應(yīng)的癌旁組織82例,良性病變組織78例。82例乳腺癌患者,年齡28~75歲,平均年齡56.7歲。其中浸潤性導(dǎo)管癌75例,浸潤性小葉癌2例,其他5例。

    1.2 研究方法

    1.2.1 組織標本的基因組DNA 采用組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA(德國Qiagen)。具體操作按試劑盒說明書進行。 DNA/RNA微量定量儀測定所提基因組DNA濃度及OD260/OD280。

    1.2.2 基因組DNA亞硫酸氫鹽修飾 采用DNA Cp G島甲基化修飾試劑盒(Cp Genome DNA Modification Kit,Chemicon公司,S7820)對DNA樣品進行亞硫酸氫鈉修飾。具體操作按試劑盒說明書進行。取1.0 μg DNA 樣品溶于100 μL H2O 中,加入7.0 μL 3M NaOH,50℃溫育10 min。加入550 μL新鮮配制的DNA 修飾試劑Ⅰ,振搖后于50℃避光溫育4~16 h。然后進行脫鹽、去磺基、二次脫鹽,最后用25 μL的TE緩沖液將DNA 洗脫下來。

    1.2.3 PCR擴增 設(shè)計兩對引物,去甲基化特異性引物簡稱為U(unmethylation),甲基化特異性引物簡稱為M(methylation)。見表1。

    表1 BCSG1基因甲基化特異PCR引物序列

    每個PCR反應(yīng)體積為25 μL,內(nèi)含:1.5 mmol/L的MgCl2,200 μmol/L的dNTPs,200 nmol/L的引物,經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA樣品1 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃ 15 min,95℃ 40秒,52℃或60℃ 40秒,72℃40秒,共40個循環(huán),最后72℃ 10 min。

    1.2.4 PCR產(chǎn)物分析 取8 μL PCR產(chǎn)物于2.0%的瓊脂糖凝膠中,100 V電泳約30 min。于凝膠成像系統(tǒng)中進行成像分析。

    1.2.5 甲基化狀態(tài)判定標準 每個樣本都用兩對引物(U和M)進行MSP擴增,同批修飾處理的基因組CG位點全去甲基化和全甲基化的DNA(Chemicon公司),分別作為去甲基化和甲基化引物的陽性對照,二者分別只能由去甲基化引物和甲基化引物擴增出相應(yīng)大小的條帶;陰性對照采用加ddH2O而不加模板的PCR體系,見圖1。若該基因發(fā)生了甲基化,則用甲基化特異性引物可擴增出相應(yīng)大小的條帶,用M表示;若為去甲基化,則用去甲基化特異性引物可擴增出相應(yīng)大小的條帶,用U表示;若該基因發(fā)生了部分甲基化,則甲基化和去甲基化特異性引物均可擴增出相應(yīng)大小的條帶。見圖2。

    圖1 MSP檢測BCSG1甲基化狀態(tài)的對照體系;U-DNA:基因組CG位點全去甲基化DNA;M-DNA:基因組CG位點全甲基化DNA;U:去甲基化特異性引物;M:甲基化特異性引物

    圖2 MSP檢測石蠟包埋乳腺組織BCSG1甲基化狀態(tài)

    1.2.6 PCR產(chǎn)物測序 為驗證MSP的特異性,隨機選取PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

    1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用EpiInfo 6軟件,采用兩樣本率的χ2檢驗或者Fisher′s確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 乳腺癌組織中BCSG1甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果

    本組研究中所有組織標本中均檢測到去甲基化狀態(tài)的存在,其中在82例乳腺癌和相應(yīng)癌旁組織中分別有27例(32.9%)和15例(18.3%)檢測到純合性去甲基化,78例乳腺良性病變組織25例(32.1%)檢測到純合性去甲基化;82例乳腺癌和相應(yīng)癌旁組織分別有55例(67.1%)和67例(81.7%)檢測到甲基化,78例乳腺良性病變組織53例(67.9%)檢測到甲基化,均為雜合型甲基化;BCSG1的完全去甲基化狀態(tài)在乳腺癌旁組織與癌組織(χ2=4.61,P<0.05)、癌旁組織與良性病變組織間(χ2=4.04,P<0.05)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2~4。

    表2 各種乳腺組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

    表3 乳腺癌組織與癌旁組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

    表4 乳腺良性病變組織與癌旁組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

    2.2 BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

    統(tǒng)計結(jié)果顯示,BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌患者年齡,腫瘤大小,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況,組織學(xué)類型,病理分級之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

    表5 BCSG1甲基化狀態(tài)與臨床資料間的關(guān)系

    3 討論

    BCSG1第一外顯子區(qū)域的CpG島的甲基化狀態(tài)是影響其轉(zhuǎn)錄的主要機制之一,而BCSG1甲基化則有可能成為乳腺癌的標志物。然而,DNA甲基化可受遺傳背景、環(huán)境因素等諸多因素的影響,在不同種族人群中,同一基因的甲基化狀態(tài)及其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用可能存在較大差異。Gupta等[12-16]的研究就表明,GSTP1,CD44和E-Cadherin等基因的甲基化狀態(tài)在不同種族人群中存在較大差異。本文研究了乳腺癌患者BCSG1甲基化及其與臨床資料的關(guān)系并得到如下結(jié)果:(1)乳腺癌、癌旁組織以及乳腺良性病變組織中BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)均存在去甲基化;(2)其甲基化狀態(tài)與臨床指標之間無顯著關(guān)聯(lián)。已有報道顯示[8],乳腺癌組織中BCSG1的甲基化頻率比乳腺癌旁組織和良性病變組織低,而我們的研究結(jié)果顯示,不僅在癌旁組織,良性病變組織中BCSG1的甲基化頻率亦低于乳腺癌旁組織,提示BCSG1的去甲基化在腫瘤發(fā)生進程中所起的作用。與國外報道[11-12]不同 ,在中國人群正常組織中,我們也檢測到BCSG1的去甲基化狀態(tài),這一結(jié)果提示我們將甲基化狀態(tài)用作腫瘤標志物時需考慮遺傳背景及種族間的差異。

    綜上所述,我們的結(jié)果顯示在中國人群乳腺癌患者中,BCSG1具有獨特的甲基化狀態(tài)和表達模式,這一結(jié)果提示BCSG1的甲基化狀態(tài)及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用可能因種族和遺傳背景的不同而不同。而BCSG1是否能用作乳腺癌輔助診斷和預(yù)后判斷的分子標志物還需要在不同種族、不同遺傳背景的人群中進行大規(guī)模樣本的研究。

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