巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

方園園

摘 要:經(jīng)過(guò)近20年的不斷開(kāi)發(fā)和完善,巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)已經(jīng)成為目前最成功的真核表達(dá)系統(tǒng)之一,被廣泛用于醫(yī)藥生產(chǎn)、飼料添加劑開(kāi)發(fā)和科學(xué)研究。介紹了畢赤酵母的生物學(xué)特性、常用菌株和表達(dá)載體的特點(diǎn)及其研究進(jìn)展,并闡述了其在外源蛋白的表達(dá)方面具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

關(guān)鍵詞:畢赤酵母;表達(dá)載體;外源蛋白

中圖分類號(hào):Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1005-569X(2009)12-0037-03

1 引 言

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)是一類在缺乏葡萄糖或甘油時(shí),能利用甲醇做為唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉價(jià)的非選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng),有較寬的生長(zhǎng)pH適應(yīng)范圍(3.0～8.0),有較好的發(fā)酵基礎(chǔ),非常有利于實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng),菌體密度可高達(dá)100g干細(xì)胞/L,它們生長(zhǎng)的適宜溫度一般為28～30℃,是常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

2 巴斯德畢赤酵母宿主菌株

根據(jù)對(duì)甲醇利用的情況,P.pastoris可劃分為三種表型:第一型,即Mut+型,此型畢赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率與野生型類似,稱為甲醇利用正表型。絕大多數(shù)畢赤酵母為Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型畢赤酵母的AOX1基因部分敲除,被釀酒酵母ARG4基因所取代,AOX2雖然與AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培養(yǎng)基內(nèi)該型畢赤酵母生長(zhǎng)緩慢,稱為甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型畢赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,細(xì)胞不能進(jìn)行甲醇代謝,無(wú)法在甲醇中生長(zhǎng),為甲醇利用負(fù)表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。后兩者表達(dá)外源蛋白有時(shí)優(yōu)于野生株,且需甲醇較少,有時(shí)其表達(dá)量甚至高于Mut+型。三型菌株在AOX1啟動(dòng)子調(diào)控下均可誘導(dǎo)異源蛋白的表達(dá)。對(duì)這三種菌株的進(jìn)一步改造,還可得到其它衍生宿主菌,現(xiàn)已獲得十幾種不同基因型的衍生宿主菌。目前,使用最廣泛的巴斯德畢赤酵母宿主菌是Cregg在1985年建立的GS115,它具有組氨酸脫氫酶缺陷型基因His4,可接受His4的載體而具有His+表型。

3 畢赤酵母表達(dá)載體

畢赤酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒,所以表達(dá)載體需與宿主菌染色體發(fā)生同源重組,將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)[1]。表達(dá)載體主要元件包括:啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止序列、選擇標(biāo)志以及可以誘導(dǎo)基因發(fā)生重組的同源序列。

表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒,先在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增,然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。因此,表達(dá)載體還含有大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制單元(ColE1)以及篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記(如Ampr,Kanar)。若要表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外,表達(dá)載體還需攜帶信號(hào)肽序列。

3.1 啟動(dòng)子

目前最常用的啟動(dòng)子是來(lái)源于巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因的啟動(dòng)子PAOX1。它是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子,能非常有效地控制外源基因的表達(dá)。雖然利用PAOX1已成功表達(dá)了多種外源蛋白,但以PAOX1為啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)還有一定缺陷,例如不適用于食品生產(chǎn),添加甲醇誘導(dǎo)時(shí)存在火災(zāi)隱患。3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子PGAP是Waterham等近年來(lái)克隆成功的一個(gè)構(gòu)成性表達(dá)的啟動(dòng)子,它突出的特點(diǎn)是發(fā)酵過(guò)程操作簡(jiǎn)便,可以連續(xù)表達(dá),無(wú)需誘導(dǎo)。利用PGAP表達(dá)外源基因主要的限制是目的蛋白不能對(duì)宿主菌有毒性,否則在長(zhǎng)期的發(fā)酵過(guò)程中將限制其生長(zhǎng)。

Shen等又克隆出FLD1(谷胱甘肽依賴性甲醛脫氫酶基因)啟動(dòng)子,它具有與AOX1啟動(dòng)子相同或更高的強(qiáng)度,能在甲胺(葡萄糖、甘油等)或甲醇為唯一碳源的情況下表達(dá),甲胺不易揮發(fā),更適于搖瓶研究。這三種啟動(dòng)子都是導(dǎo)致外源基因過(guò)高表達(dá)的啟動(dòng)子,但有研究發(fā)現(xiàn),某些外源基因可因被啟動(dòng)的表達(dá)水平過(guò)高,而導(dǎo)致目的蛋白折疊失準(zhǔn),加工無(wú)能或定位錯(cuò)誤。因此,近年來(lái)人們又研制了啟動(dòng)基因柔和表達(dá)的啟動(dòng)子如PEX8和YPT1啟動(dòng)子,但它們的表達(dá)水平要低于上述三種強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子各有優(yōu)缺點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)根據(jù)自己的需要選擇合適的啟動(dòng)子。

3.2 選擇標(biāo)志

常用的選擇標(biāo)記可以分為兩種:①營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記,如來(lái)源于巴斯德畢赤酵母的HIS4基因和來(lái)源于釀酒酵母的ARG4基因和SUC2基因;②抗性選擇標(biāo)記,如來(lái)源于大腸桿菌Tn903能夠使真核細(xì)胞對(duì)卡那霉素家族成員G418產(chǎn)生抗性的kanr基因,又如來(lái)源于印度斯坦鏈異壁菌(streptoalloteichus hindustanus)能夠使細(xì)菌和真核細(xì)胞對(duì)博萊霉素家族成員Zeocin產(chǎn)生抗性的Shbler基因,但Zeocin是一種強(qiáng)誘變劑,可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生不可預(yù)料的突變。近來(lái),還成功獲得一系列新的營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記,如巴斯德畢赤酵母氨基咪唑琥珀酸草酰二胺合成酶基因(ADE1)和乳清酸核苷-5&-磷酸脫羧酶基因(URA3)。

3.3 信號(hào)肽

分泌性的外源蛋白可以采用自身的信號(hào)肽來(lái)實(shí)現(xiàn)分泌,但是大多數(shù)外源信號(hào)肽不能在畢赤酵母中有效表達(dá),可以考慮采用酵母自身的信號(hào)肽。由于畢赤酵母表達(dá)的分泌性蛋白很少,不易找到合適的信號(hào)肽,從釀酒酵母分離到的α-交配因子前導(dǎo)肽,它不僅可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)沿分泌通路分泌到細(xì)胞外,而且在分泌過(guò)程中可以被自身的膜蛋白酶Kex2自動(dòng)切割去除。

如果表達(dá)胞內(nèi)蛋白的話就不需要信號(hào)肽了,可以在目的蛋白前加一個(gè)定向肽(peroxisome targetingsignal,PTS),可以把目的蛋白聚集到微體中,既避免了胞內(nèi)過(guò)量積累外源蛋白對(duì)細(xì)胞正常生理功能的影響,又可以保護(hù)外源蛋白免受胞內(nèi)蛋白酶的降解。

4 利用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)

畢赤酵母作為一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)生長(zhǎng)力旺盛、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求低、生活周期短、易培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn),也具備其作為近幾年來(lái)廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),可以對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行加工修飾使蛋白更接近天然的狀態(tài),形成有活性的蛋白。與第一代真核表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母相比,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì):

(1)穩(wěn)定性高。由于畢赤酵母沒(méi)有游離的質(zhì)粒,外源基因進(jìn)入細(xì)胞后通過(guò)交換整合進(jìn)入酵母的基因組中成為畢赤酵母基因組的一部分,外源基因不會(huì)丟失,遺傳穩(wěn)定性好。

(2)表達(dá)量高。在畢赤酵母中采用了AOX1啟動(dòng)子作為外源基因的啟動(dòng)子,AOX1啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子,在甲醇誘導(dǎo)下可以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá),比以往的表達(dá)系統(tǒng)提高了10～100倍[2]。而且由于AOX1是甲醇誘導(dǎo)型的可以通過(guò)控制甘油和甲醇的比例來(lái)控制外源蛋白的表達(dá)。

(3)分泌效率高。采用釀酒酵母α成熟因子(α-MF)信號(hào)序列可以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)蛋白的分泌表達(dá),也有采用外源蛋白自身信號(hào)肽來(lái)分泌并獲得成功的例子,如HAS[3]、轉(zhuǎn)化酶[4,5]、牛的溶菌酶[6]。

(4)自身分泌的蛋白較少。細(xì)胞外大部分是目的蛋白,而且營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單,培養(yǎng)基中其他的蛋白成分少,背景比較干凈清楚,這就為下游分離純化蛋白提供了便利。

(5)糖基化更接近蛋白的天然狀態(tài)[7],糖基側(cè)鏈較釀酒酵母短約為它的20%[8],作為藥物治療時(shí)不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)。

此外,畢赤酵母偏好有氧的生長(zhǎng)環(huán)境,菌體可以達(dá)到很高的密度(細(xì)胞干重可達(dá)100g/L以上),適應(yīng)較寬的pH(3.0～8.0),這些特點(diǎn)使得畢赤酵母適于大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生大量的外源蛋白。

但是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)也有一些不盡如人意的地方需要改進(jìn):

(1)甲醇做誘導(dǎo)物存在安全隱患。甲醇有毒過(guò)量能夠?qū)е率?表達(dá)一些口服藥物以及食品蛋白時(shí)往往不能被人們接受,而且甲醇易揮發(fā),為大規(guī)模的工業(yè)化生長(zhǎng)帶來(lái)了火災(zāi)的遺患。

(2)畢赤酵母的遺傳背景還沒(méi)有釀酒酵母那么清楚,為開(kāi)展實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了諸多不便。

(3)目前有越來(lái)越多的低表達(dá)或不表達(dá)的報(bào)導(dǎo)出現(xiàn),比如多瘤病毒大T抗原,還有的甚至不能表達(dá)(如HIV表面糖蛋白)[9]。影響蛋白表達(dá)量的因素很多,需要不斷摸索尋找最佳表達(dá)條件,實(shí)際操作很繁瑣。

5 結(jié) 語(yǔ)

巴斯德畢赤酵母是一種嗜畢赤酵母,起初是菲利普石油公司為了生產(chǎn)家畜飼料單細(xì)胞蛋白而開(kāi)發(fā)的,它可以在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。自l987 年Gregg等首次在畢赤酵母中表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)以來(lái),國(guó)內(nèi)外已有數(shù)百種外源蛋白獲得表達(dá)。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)勢(shì)使之越來(lái)越受到關(guān)注,其研究和商業(yè)價(jià)值亦不斷體現(xiàn)。近年來(lái),隨著對(duì)該甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母分子遺傳學(xué)研究和認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的不斷積累,巴斯德畢赤酵母基因表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍大大加寬,表達(dá)產(chǎn)物除了人畜藥用制品外,還包括來(lái)自植物、動(dòng)物和細(xì)菌的各種酶、膜受體蛋白、含輔基的蛋白質(zhì)以及可用于研究晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)等,它還可以同時(shí)表達(dá)酶組分比例適當(dāng)?shù)囊粋€(gè)酶系而以全細(xì)胞作為生物催化劑,對(duì)整個(gè)生命科學(xué)和人類健康產(chǎn)生重要影響。同時(shí)我們也相信,該表達(dá)系統(tǒng)必將在我國(guó)21世紀(jì)基因工程真核表達(dá)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化、商品化進(jìn)程中,發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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