月季玫瑰遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究進(jìn)展

邢瀚文 季 靜 王 罡 杜長(zhǎng)城 楊少輝 宋英今

摘要:對(duì)近年來(lái)月季和玫瑰遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述,為它們建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:月季;玫瑰;植株再生;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào):S685.12文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.004

Advances in Genetic Transformation Systems of Roses

XING Han-wen1,JI Jing1,WANG Gang1,DU Chang-cheng2,YANG Shao-hui1,SONG Ying-jin1

(1.College of Agriculture and Bioengineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China;2.Tianjin Forestry Bureau,Tianjin 300061,China)

Abstract:System establishment and researches of genetic transformation of rose in recent years were reviewed in this article, in order to lay a theoretical foundation for the establishment of efficient genetic transformation system of rose.

Key words:Chinese rose;plant regeneration;genetic transformation

月季( Rosa hybrida L.) 和玫瑰(Rosa rugosa)都是薔薇科薔薇屬植物,是世界上最重要的觀賞植物之一,世界四大切花之一,也是各類高級(jí)食品、化妝品的重要香料原料,因而具有極高的商業(yè)價(jià)值。目前,月季和玫瑰育種是花卉育種較活躍的領(lǐng)域,主要集中在對(duì)花色、花形、開花習(xí)性、鮮切花壽命、株型、抗病性等的改良上[1]。但是傳統(tǒng)的育種方法存在著諸如:為多年生灌木,育種所需時(shí)間較長(zhǎng);基因資源有限,染色體數(shù)目及倍性差異使遠(yuǎn)緣雜交難以成功;生長(zhǎng)一致性、開花同時(shí)性等多基因控制性狀難以改良等問題。

20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為月季和玫瑰育種提供了一條新途徑。這種方法不但使品種在外源基因所控制的性狀上發(fā)生改變,其性狀保持相對(duì)穩(wěn)定,還可利用來(lái)自其他生物類型的基因,創(chuàng)造更優(yōu)良的品種[2]。筆者著重介紹了月季遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究進(jìn)展,為進(jìn)行月季基因工程改良,培育月季優(yōu)秀新品種提供借鑒。同時(shí),玫瑰與月季在遺傳轉(zhuǎn)化方面非常相似,在此不再贅述。

1月季遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

月季遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要前提條件,轉(zhuǎn)基因成功與否在很大程度上依賴于再生體系是否高效。植株再生可通過器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn),依據(jù)是否經(jīng)過愈傷組織階段進(jìn)一步分為直接再生和間接再生兩種[2]。目前可以通過直接再生、間接再生、體細(xì)胞胚再生等方法建立月季遺傳轉(zhuǎn)化體系[3]。

1.1直接再生

Lloyd等[4]在僅含有BA和NAA的培養(yǎng)基上直接從桃子(R. persica×R. xanthina)的葉和根,金英子(R.1aevigata)和光葉薔薇(R.wichuraiana)的葉上誘導(dǎo)出不定芽,但未報(bào)道誘導(dǎo)率。Dubois和de Vries等[5]報(bào)道在1/2MS + TDZ 6.8 μmol/L + NAA 0.27 μmol/L的培養(yǎng)基上,可從葉片直接再生不定芽,切花月季品種不同,分化情況不同。這是目前所報(bào)道再生率最高,需時(shí)最短的再生方法。最大發(fā)生率是在葉片基部和葉鞘基部,加入AgNO3可以縮短不定芽發(fā)生時(shí)間,提高不定芽再生頻率。再生率越高的品種,再生所需時(shí)間越短,不定芽生長(zhǎng)越快,且再生芽數(shù)也越多,并且田間苗較組培苗的效果好。

1.2間接再生

芽體再生主要以根、節(jié)間、葉片、葉柄等為外植體,但對(duì)這方面的研究報(bào)道并不多。誘導(dǎo)愈傷的基本培養(yǎng)基為MS、SH、N6等,激素有BA、GA、2,4-D、NAA、KT等。誘導(dǎo)芽體的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、改良MS培養(yǎng)基等,激素有BA、NAA等。誘導(dǎo)不定芽再生率通常不高,并且非常受基因型的限制,具有器官發(fā)生能力的愈傷組織也無(wú)法繼代增殖,因此,此再生途徑的應(yīng)用有一定的局限性。

1.3體細(xì)胞胚再生

多以葉片、節(jié)間、雄蕊花絲、根和合子胚等為外植體。品種不同,外植體不同,對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚的發(fā)生以及再生植株的形成有重要影響。品種,即基因型是最重要的影響因素,一些月季品種在目前的研究中沒有獲得再生。Noriega和Sondahl指出體細(xì)胞胚再生過程中重要的一步是從初級(jí)體細(xì)胞胚上誘導(dǎo)和保持脆性胚性愈傷組織,低水平的NAA/ZT(玉米素)有利于誘導(dǎo),而高水平的NAA/ZT有利于保持。

影響體細(xì)胞胚再生的培養(yǎng)條件有溫度、光照等。體細(xì)胞胚發(fā)育前期適當(dāng)?shù)牡蜏嘏囵B(yǎng)(4～8 ℃)有利于體細(xì)胞胚的萌發(fā),同時(shí)還需要生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。Dohm等[6]報(bào)道體胚的萌發(fā)是零星發(fā)生的,Kim等[7]報(bào)道的體胚萌發(fā)率為11%。為提高萌發(fā)效率采取的措施主要是強(qiáng)光照、低溫和ABA處理。Yokoya等[8]采用ABA和低溫聯(lián)合處理,并使用麥芽糖代替蔗糖,通過胚的萌發(fā)和不定芽的再生,使25%的體細(xì)胞胚成苗。

2月季的遺傳轉(zhuǎn)化研究

目前,月季轉(zhuǎn)化系統(tǒng)大多采用胚性愈傷組織或體細(xì)胞胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化,但其再生系統(tǒng)還不夠完善,主要表現(xiàn)為再生率不高,且明顯受基因型限制。因此,月季轉(zhuǎn)基因的報(bào)道還很有限。

鄭玉梅等目前用于月季轉(zhuǎn)化的報(bào)告基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptⅡ)基因、β-葡萄糖酸苷酶(GUS)基因、熒光酶素(LUC)基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因。通過利用報(bào)告基因可以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的快速檢測(cè)。目的基因有rol抗菌基因、抗幾丁質(zhì)酶基因、抗菌蛋白基因、CHS基因等。

月季遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。Firoozababy等(1991)首次成功地進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的月季轉(zhuǎn)化。他們以月季一品種(R.hybrida cv.Royalty)為供試材料,將其胚性愈傷與含有pnos NPT II/p35S LUC質(zhì)粒的致瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404或與含有pnos NPT II/p35SGUS質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenesis) 15834共培養(yǎng),得到了很高的轉(zhuǎn)化愈傷頻率,即每克愈傷約產(chǎn)生40～60個(gè)獨(dú)立的抗卡那霉素愈傷,通過LUC或GUS和PCR技術(shù)檢測(cè),幾乎100%的抗性愈傷為轉(zhuǎn)化愈性。農(nóng)桿菌菌株及質(zhì)粒種類對(duì)轉(zhuǎn)化影響不大,根癌農(nóng)桿菌LBA4404 或發(fā)根農(nóng)桿菌15834 的轉(zhuǎn)化效率無(wú)顯著差異,根癌農(nóng)桿菌GV3101、EHA105 和GV2260也都有成功報(bào)道,但農(nóng)桿菌的預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率有一定影響。Dohm等[9]報(bào)道使用根癌農(nóng)桿菌EHA105 和GV2260 時(shí),搖菌時(shí)間不應(yīng)超過2 h,共培養(yǎng)時(shí)間分別為2 d和6 d。共培養(yǎng)的結(jié)果是得到了再生的轉(zhuǎn)基因植株。2004年,Kim等[10]將綠色熒光蛋白基因運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化月季,并得到Southern 雜交分析驗(yàn)證。以上結(jié)果表明農(nóng)桿菌菌株及質(zhì)粒種類對(duì)轉(zhuǎn)化影響不大,但農(nóng)桿菌的預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率有一定影響。

除農(nóng)桿菌介導(dǎo)法外,還有基因槍法。Marchant等[11]以胚性愈傷組織細(xì)胞為對(duì)象,通過轉(zhuǎn)化GUS報(bào)告基因,將基因槍法的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。此后他又成功地將來(lái)自水稻的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入月季一品種(R.hybrida ‘Glad Tidings ),使該品種月季黑斑病的發(fā)生率降低13%～43%,抗病效果與幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量呈正相關(guān)[12]。

目前,月季轉(zhuǎn)基因植株再生方法多用體細(xì)胞胚再生。報(bào)告基因檢測(cè)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)、South雜交法、North雜交法等分子生物學(xué)方法用于檢測(cè)基因是否在轉(zhuǎn)基因月季細(xì)胞中存在并表達(dá)。之后還要進(jìn)行生物學(xué)鑒定,以確定外源基因能否正常的表達(dá)性狀,并穩(wěn)定地遺傳給后代。

3展望

近年來(lái)在月季和玫瑰的組培和轉(zhuǎn)化方面雖然取得了較大的進(jìn)展,但只有少數(shù)品種建立了高效再生體系,轉(zhuǎn)基因多數(shù)還停留在報(bào)告基因轉(zhuǎn)化的水平,外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)和穩(wěn)定性的報(bào)道不多,至今未有在生產(chǎn)中推廣的轉(zhuǎn)基因月季和玫瑰品種。而月季原產(chǎn)我國(guó),我們擁有許多優(yōu)良種質(zhì)資源和基因資源,對(duì)一些具有商業(yè)價(jià)值的月季品種進(jìn)行組培再生系統(tǒng)的研究,及應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法對(duì)月季的花色、花期、鮮切花壽命等進(jìn)行研究,完全可能培育出具有商業(yè)價(jià)值和有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新月季品種[13]。

參考文獻(xiàn):

[1] 黃善武.月季育種[M]//程金水.園林植物遺傳育種學(xué).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000:385-401.

[2] 高莉萍,包滿珠.月季的植株再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào),2005,22(2):231-237.

[3] 鄭玉梅,馬神,劉青林.月季遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2003,23(2):79-82.

[4] Lloyd D,Roberts A V,Short K C. The induction in vitro of adventitious shoots in Rosa[J].Euphytica,1988,37:31-36.

[5] Dubois L A M, De Vries D P. The direct regeneration of advertitious buds on leaf explants of glasshouse grown cut rose cultivars[J].Acta Horticulturae,1996,424:327-331.

[6] Dohm A,Ludwig C,Nehring K,et al. Somatic embryogenesis in roses[J].Acta Horticulturae,2001, 547:341-348.

[7] Kim C K,Chung J D,Jee S O,et al. Somatic embryogenesis from in vitro grown leaf explants of Rosa hybrida L[J].Journal of Plant Biotechnology,2003(5):169-172.

[8] Yokoya K,Walker S,Sarasam V. Regeneration of rose plants from cel1 and tissue cultures[J].Acta Horticulturae,1996,424:333-337.

[9] Dohm A,Ludwig C,Schilling D,et al. Transformation of roses with genes for antifungal proteins[J].Acta Horticulturae, 2001, 547: 27-34.

[10] Kim C K,Chung J D,Park S H,et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Rosa hybrida using the green fluorescent protein (GFP) gene[J].Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2004,78:107-111.

[11] Marchant R,Power J B,Lucas J A,et al. Biolistic transformation of rose(Rosa hybrida L.)[J].Annals of Botany,1998,81:109-114.

[12] Marchant R,Davey M R,Lucas J A,et al. Expression of a chitinase transgene in rose(Rosa hybrida L.)reduces development of black disease(Diplocarpon rosae Wolf)[J].Molecular Breeding,1998(4):187-194.

[13] 李美茹,李洪清,孫梓健,等.月季的組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].廣西植物,2003,23(3):243-249.