組蛋白去乙酰化酶6在慢性哮喘小鼠肺組織中的表達形態(tài)

任媛，蘇新明，陸常玲，李朋，李孟露，康健

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，沈陽 110001）

哮喘的本質是由多種細胞以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。隨著哮喘病程的延長，肺組織結構細胞如上皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等可發(fā)生一系列改變，最終導致基底膜破壞、平滑肌增厚、血管再生、上皮下纖維化等重塑性改變，為哮喘的臨床治療帶來了極大的困擾［2-4］。組蛋白去乙?；? （histone deacetylase 6，HDAC6） 是Ⅱ類HDAC家族的重要成員，主要表達于細胞質中，參與調控體內炎癥反應、細胞增殖分化、平滑肌增殖遷移以及膠原分泌等諸多病理過程［5-8］。近年來越來越多的證據(jù)顯示，HDAC6很可能在哮喘致病過程中發(fā)揮了關鍵作用，選擇性的抑制肺組織中HDAC6的表達有望為哮喘治療提供新方法。本研究的目的是明確哮喘致病時HDAC6在肺組織中的表達形態(tài)，闡明HDAC6與哮喘致病間的關系，為HDAC6特異性抑制劑用于哮喘治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 制備哮喘模型及分組

6～8周SPF級雌性BALB/C小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司［動物許可證號：SCXK （遼） 2010-0001］。采用隨機數(shù)字表法將BALB/C小鼠分為正常組和哮喘組，每組12只。于實驗第0、7、14天，哮喘組小鼠予以卵蛋白 （ovalbumin，OVA） （20 μ g） 和氫氧化鋁凝膠 （2 mg） 混懸液腹腔注射致敏。末次致敏1周后，應用超聲霧化裝置 （3 mL/min） 進行OVA （20 mg/mL） 霧化激發(fā)8周，3次/周，30 min/次。正常組均以等量生理鹽水代替OVA處理。

1.2 HE染色評估哮喘建模

末次激發(fā)實驗24 h后，各組小鼠麻醉處死，取左側肺組織 （n = 6） ，固定，包埋，切片 （0.5 μ m） 后行HE染色。石蠟切片脫蠟水化，蘇木素染色5～10 min，自來水沖洗5 min，鹽酸乙醇分化3 s，自來水洗返藍30 min，伊紅復染1～2 min，自來水洗去浮色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察哮喘組小鼠氣道肺組織炎癥浸潤水平。

1.3 免疫組織化學染色觀察HDAC6在肺組織中的表達分布

采用SP法行肺組織HDAC6免疫組化染色 （n = 6） 。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5 min，PBS 洗3次，5 min/次；微波爐抗原修復24 min，6 min/次，PBS洗3次，5 min/次；10% BSA室溫孵育30 min，HDAC6多克隆抗體 （1∶100，美國Santa Cruz公司） 4 ℃孵育過夜。二抗 （1∶500） 37 ℃ 孵育60 min，PBS 洗3次，5 min/次；DAB法顯色5～10 min，自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水，透明，封片。光鏡下觀察HDAC6在各組小鼠肺組織中的表達分布。

1.4 Western blotting檢測HDAC6在肺組織中的表達水平

取右側新鮮肺組織 （n = 3） 30～50 mg加入RIPA裂解液 （含10% PMSF） ，冰上剪碎勻漿，超聲粉碎，4 ℃ 12 000 g離心，30 min后取上清。BCA法測蛋白濃度，調整濃度并變性后，采用SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳 （80 V，30 min；120 V，90 min） 分離。將蛋白轉染到PVDF膜上 （0.25 mA，60 min） ，脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h。HDAC6多克隆抗體 （1∶1 000，美國Santa Cruz公司） 4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h，ECL法檢測蛋白表達，UVP系統(tǒng)成像，Gel-Pro Analyzer凝膠定量分析軟件進行結果分析。

1.5 比色法分析檢測HDAC6在肺組織中的酶活性

取右側新鮮肺組織 （n = 6） ，采用蛋白抽提試劑盒提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，比色法檢測肺組織中HDAC6酶活性，操作方法按試劑盒 （EpiQuik HDAC6 Assay Kit，美國Epigentek公司） 內附說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 哮喘小鼠肺組織中炎癥浸潤水平

正常組小鼠肺組織中各級氣道及血管周圍未見炎癥細胞浸潤，基底膜完整，氣道上皮細胞排列整齊。與正常組相比，哮喘組小鼠各級氣道及血管周圍可見大量以嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，基底膜脫落，上皮下纖維化。病理染色結果顯示哮喘建模成功。見圖1。

2.2 HDAC6在肺組織中的表達分布

2.2.1 HDAC6高表達于哮喘小鼠氣道上皮細胞：正常組小鼠氣道上皮細胞質中可見極少量的HDAC6表達。與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠氣道上皮細胞細胞核和細胞質中HDAC6表達水平顯著升高，尤其在脫落的氣道上皮細胞中HDAC6表達水平明顯升高。見圖2。

2.2.2 HDAC6高表達于哮喘小鼠上皮下炎癥細胞：正常組小鼠肺組織氣道血管周圍未見炎癥細胞浸潤。與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠氣道血管周圍可見大量炎癥細胞浸潤，且浸潤的炎癥細胞中可見HDAC6陽性染色。見圖3。

圖1 2組小鼠肺組織病理染色Fig.1 Pathological staining of lung tissue of mice in the two groups

圖2 HDAC6在2組小鼠氣道上皮細胞中的表達情況Fig.2 HDAC6 expression in airway epithelial cells of mice in the two groups

圖3 HDAC6在2組小鼠上皮下炎癥細胞中的表達情況Fig.3 HDAC6 expression in the subepithelial inflammatory cells of mice in the two groups

2.2.3 HDAC6表達于哮喘小鼠平滑肌細胞：正常組小鼠氣道和血管平滑肌細胞中HDAC6表達極少。OVA霧化8周后，可見哮喘組小鼠氣道平滑肌細胞和血管平滑肌細胞細胞質中HDAC6陽性表達，與正常組小鼠相比，HDAC6在平滑肌細胞中表達水平升高。見圖4。

2.2.4 HDAC6高表達于哮喘小鼠肺泡腔炎癥細胞：正常組小鼠肺泡腔中可見少量巨噬細胞，且巨噬細胞中HDAC6表達極少。與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠肺泡腔中可見以巨噬細胞和嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，且在這些細胞的細胞核和細胞質中HDAC6表達水平顯著升高。見圖5。

圖4 HDAC6在2組小鼠平滑肌細胞中的表達情況Fig.4 HDAC6 expression in smooth muscle cells of mice in the two groups

圖5 HDAC6在2組小鼠肺泡腔炎癥細胞中的表達情況Fig.5 HDAC6 expression in alveolar inflammatory cells of mice in the two groups

2.3 HDAC6在哮喘小鼠肺組織中的表達水平

采用Western blotting進一步檢測HDAC6在肺組織中的總體表達水平，正常組為1.00，哮喘組為3.40±0.68。與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠肺組織中HDAC6的總體表達水平顯著升高，2組間差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） 。見圖6。

圖6 Western blotting檢測HDAC6在2組小鼠肺組織中的表達水平Fig.6 HDAC6 levels in the lung tissue of mice in the two groups were detected by Western blotting

2.4 HDAC6在哮喘小鼠肺組織中酶活性的變化

采用比色法檢測HDAC6在正常組和哮喘組小鼠肺組織的酶活性，正常組為 （0.50±0.07） ng/μ g，哮喘組為 （1.15±0.18） ng/μ g。哮喘致病時肺組織中HDAC6酶活性顯著升高，2組間差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05） 。

3 討論

HDAC6是HDAC家族的重要成員，不同于其他HDAC成員，HDAC6具有2個高度同源且均含有鋅指結構的催化區(qū)域，共同調控HDAC6的酶活性［9］。同時，HDAC6作為一個重要的細胞質蛋白，能夠穿梭于細胞核和細胞質之間，具有諸多組蛋白和非組蛋白底物，與細胞內錯誤折疊蛋白反應、細胞黏附和遷移、上皮間充質轉化、炎癥細胞滲出、自噬反應以及DNA損傷修復等諸多病理過程密切相關［10］。CHOI等［11］發(fā)現(xiàn)HDAC6特異性抑制劑Tubastatin A Hcl能夠顯著抑制轉化生長因子β 1 （transforming growth factor β 1，TGF-β 1） 介導的組蛋白乙?；?，抑制Smad2/3與纖維化相關基因啟動子區(qū)DNA的結合水平，最終抑制高血壓腎病中腎臟纖維化和炎癥性改變。最新研究［12-15］表明，HDAC6能夠通過調控其底物蛋白熱休克蛋白90的乙?；揎椝?，影響核轉錄因子κ B通路和TGF-β 1的激活，進而調控下游通路的炎癥反應和纖維化過程。綜合現(xiàn)有的研究進展發(fā)現(xiàn)，HDAC6不僅在惡性腫瘤及神經退行性疾病中具有重要作用，而且在心血管疾病、炎癥性疾病及腎臟纖維化等相關疾病中亦具有重要作用。

本研究結果顯示，哮喘致病時肺組織中HDAC6表達水平和酶活性均顯著升高，尤其在氣道上皮細胞、氣道血管周圍炎癥細胞、肺泡腔巨噬細胞和平滑肌細胞中，可見HDAC6表達水平顯著高于正常小鼠。這一異常改變很可能與哮喘致病時嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞、平滑肌細胞等眾多細胞被激活，參與氣道炎癥和重塑性反應相關。本課題組前期研究［16-17］結果也顯示，HDAC6特異性抑制劑 （Tubastatin A Hcl） 干預能夠有效減輕哮喘小鼠肺組織中的炎癥水平，緩解哮喘氣道重塑和氣道高反應的發(fā)生，包括抑制支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞和細胞因子分泌、減輕肺組織氣道血管周圍炎癥細胞浸潤、降低氣道上皮黏液腺化生、抑制上皮下膠原沉積以及上皮下纖維化、緩解平滑肌增厚等。尤其在抑制哮喘氣道重塑和氣道高反應方面，HDAC6特異性抑制劑的效果要略優(yōu)于激素和其他HDAC抑制劑干預［16］。這一作用特點很可能與HDAC6在哮喘相關致病細胞中的作用相關，即HDAC6參與并調控絲裂原活化蛋白激酶、核轉錄因子κ B以及TGF-β 1相關通路的激活［18］，最終影響哮喘肺組織中的炎癥水平和重塑性改變。根據(jù)HDAC6在哮喘致病時表達形態(tài)的變化以及HDAC6特異性抑制劑對哮喘小鼠的療效，可以推測選擇性地抑制肺組織中HDAC6的表達，能夠為哮喘治療尤其是抑制哮喘肺組織重塑提供新的方法。