痰熱清注射液對AECOPD患者外周血單核細(xì)胞TLRs/NF-κB信號通路及下游細(xì)胞因子的影響*

劉 銳 葉傳冬 雷寧寧 何 嘉 侯體保 劉秀芳

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001）

在慢性阻塞性肺疾病（COPD）發(fā)病過程中，出現(xiàn)超出日常狀況，需要改變COPD日?；A(chǔ)用藥的情況稱慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）[1]。 AECOPD在中醫(yī)學(xué)中屬“咳嗽”“喘證”“肺脹”等范疇，臨床多以清熱化痰、行氣活血、宣降肺氣為治則[2]。不少研究發(fā)現(xiàn)[3-7]，痰熱清注射液清熱、解毒、化痰的作用機(jī)制可能與降低血清細(xì)胞炎癥因子白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等水平有關(guān)。本次臨床研究在已有研究明確痰熱清注射液治療AECOPD有效的基礎(chǔ)上，擬對該藥抗炎相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行探索，為該藥物的臨床運(yùn)用提供更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 1）診斷標(biāo)準(zhǔn)：痰熱郁肺證候辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[8]，癥見咳逆喘息氣粗，痰黃或白，黏稠難咯，胸滿煩躁，或發(fā)熱汗出，口渴欲飲，舌質(zhì)暗紅，苔黃或黃膩，脈滑數(shù)。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016版GOLD[9]以及 2013 年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[10]。40歲以上患者若符合下列指標(biāo)，應(yīng)考慮為COPD。（1）慢性咳嗽，可為間歇性咳嗽，伴或不伴有咯痰表現(xiàn)，發(fā)作性喘息；（2）慢性咳痰，任何形式的慢性咳痰可能提示COPD；（3）呼吸困難，隨時間進(jìn)行性加重，特征性表現(xiàn)為活動后加重，持續(xù)存在；（4）反復(fù)下呼吸道感染；（5）危險因素，宿主因素（如遺傳因素、先天發(fā)育異常等）、吸煙（包括當(dāng)?shù)亓餍械臒煵葜破罚?、家庭烹調(diào)和取暖燃料產(chǎn)生的煙霧、職業(yè)粉塵、蒸汽、煙霧、氣體，以及其他化學(xué)物質(zhì)；（6）COPD家族史和/或幼年因素，例如出生低體質(zhì)量、幼年反復(fù)呼吸道感染等；（7）支氣管擴(kuò)張劑后FEV1/FVC＜70%，可確定存在持續(xù)氣流受限。如果有相應(yīng)的癥狀和明顯的危險因素接觸，則可診斷慢阻肺；（8）AECOPD[2]，短期內(nèi)出現(xiàn)呼吸和全身狀況惡化，患者通常會有全身炎癥反應(yīng)，肺動脈高壓，甚至呼吸衰竭。2）納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為AECOPD同時符合中醫(yī)辨證為痰熱郁肺型患者，年齡40～80歲，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意且患者簽署知情同意書，并愿意接受醫(yī)生治療、完成全程治療者。3）排除標(biāo)準(zhǔn)：對本藥過敏者。具有嚴(yán)重心力衰竭（心功能Ⅳ級），合并肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)疾病、精神病患者，合并肺結(jié)核、真菌、腫瘤等肺原發(fā)病，肺性腦病患者。合并肺栓塞、氣胸、胸腔積液者。

1.2 臨床資料 選取2016年12月至2017年12月廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院呼吸內(nèi)科、老年病科AECOPD住院患者60例，按照隨機(jī)、對照原則，采用區(qū)組隨機(jī)化方法分為對照組與治療組各30例。對照組男性20例，女性10例；年齡51～79歲，平均 （73.20±5.19）歲；中醫(yī)證候評分（9.40±1.10）分；病程 5～30 年，平均（10.40±4.64）年。治療組男性22例，女性8例；年齡 49～80 歲，平均（72.60±5.67）歲；中醫(yī)證候評分（9.20±1.35）分；病程 7～28 年，平均（12.01±7.40）年。兩組資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.3 治療方法 對照組入院后給予常規(guī)改善通氣、解痙平喘、止咳化痰并根據(jù)病原學(xué)及藥敏試驗(yàn)予抗感染等治療。治療組在常規(guī)治療上另給予中成藥痰熱清注射液（上海凱寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20030054）20 mL，用250 mL 5%葡萄糖注射液或者0.9%氯化鈉注射液稀釋后靜脈滴注，每日1次，10 d為1個療程。

1.4 觀察指標(biāo) 1）細(xì)胞因子：兩組患者分別于入院第1、11日清晨抽取靜脈血5 mL，離心分離血清，-80℃保存，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測 TNF-α、IL-8、IL-17（武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司試劑盒），核因子NF-κB（美國 Active Motif公司試劑盒），具體操作見試劑說明書。2）分離外周血單核細(xì)胞及檢測單核細(xì)胞膜表面TLR4蛋白表達(dá)：兩組患者分別于入院第1、11日清晨抽取靜脈血2 mL，用肝素鈉抗凝，用紅細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）分離外周血單個核細(xì)胞兩次，4℃ 1500 r/min離心10 min，棄上清液，加入pH 7.45 PBS，1500 r/min 離心 10 min， 取 100 μL 加 入CD14-FITC抗體和TLR4-PE抗體（美國BD公司），避光4℃下孵育30 min，后4℃ 1500 r/min離心4 min，棄上清液，加PBS 400 μL，重懸過濾至流式試管中，放在FACSCalibur型流式細(xì)胞儀上測定106/100 μL外周血單核細(xì)胞中TLR4 PE-H陽性百分率。

1.5 中醫(yī)療效標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[11]，病情積分標(biāo)準(zhǔn)按等級記分。 發(fā)熱：0、1、2、3 級，計 0、2、3、4 分。痰的色、質(zhì)、量：0、1、2、3 級，計 0、2、3、4分。 咳嗽：0、1、2、3 級，計 0、2、3、4 分。 氣喘：0、1、2 級，計 0、1、2 分?？诟桑?、1、2、3 級，計 0、1、2、3 分。肺部啰音：0、1、2、3 級，計 0、1、2、3 分。 療效分為臨床控制、顯效、有效、無效4級。臨床控制：主要癥狀、體征完全或基本緩解，客觀指標(biāo)恢復(fù)正常，治療后總積分減少≥90%，即（治療前積分-治療后積分）/治療前積分×100%≥90%。顯效：主要癥狀、體征明顯緩解，客觀指標(biāo)接近正常，治療后總積分減少≥70%。有效：主要癥狀、體征好轉(zhuǎn)，客觀指標(biāo)有所改善，治療后總積分減少≥30%。無效：主要癥狀、體征無變化，客觀指標(biāo)變化不明顯或加重，治療后總積分減少＜30%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示。計數(shù)資料百分率（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。正態(tài)分布樣本組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多次比較采用重復(fù)測量方差分析。非正態(tài)分布組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床療效比較 見表1。治療組總有效率高于對照組（P＜0.05）。

表1 兩組臨床療效比較（n）

2.2 兩組治療前后血清 IL-8、IL-17、TNF-α、NF-κB水平比較 見表2。兩組治療前TNF-α、IL-8、IL-17比較，差異均不大（均P＞0.05）。兩組治療后TNF-α、IL-8、IL-17較本組治療前降低（均P＜0.05），且治療組下降幅度均大于對照組（均P＜0.05）。

表2 兩組治療前后血清TNF-α、IL-8、IL-17、NF-κB水平比較（分，±s）

表2 兩組治療前后血清TNF-α、IL-8、IL-17、NF-κB水平比較（分，±s）

與本組入院第1天比較，*P＜0.05；與對照組治療第11天比較，△P＜0.05。下同

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2.3 兩組外周血單核細(xì)胞中TLR4陽性百分率比較見表3，圖1、圖2。兩組治療前TLR4陽性百分率比較，差別不大（P＞0.05）。兩組治療后TLR4陽性百分率較本組治療前下降（P＜0.05），且治療組下降幅度大于對照組（P＜0.05）。

表3 兩組外周血單核細(xì)胞TLR4陽性百分率比較（%，±s）

表3 兩組外周血單核細(xì)胞TLR4陽性百分率比較（%，±s）

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圖1 兩組入院第1天TLR4陽性百分率情況

圖2 兩組入院第11天TLR4陽性百分率情況

3 討 論

COPD根據(jù)其咳嗽、咯痰、氣喘等癥狀歸屬于中醫(yī)學(xué)“肺脹”范疇，中醫(yī)學(xué)對于COPD病因病機(jī)的研究頗多。認(rèn)為其發(fā)生多由久病肺虛、感受外邪及年老體虛所導(dǎo)致。肺脹的基本病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，肺、腎、心、脾臟器虧虛為本，痰濁、水飲、血瘀互結(jié)為標(biāo)，二者彼此影響，互為因果，復(fù)為外邪所誘發(fā)，而致氣道壅塞，肺氣脹滿，不能斂降，發(fā)為肺脹[12]?！夺t(yī)學(xué)三字經(jīng)》言“然肺為氣之主，諸氣上逆則嗆而咳，是咳嗽不止于肺，而亦不離乎肺也”[13]。關(guān)于COPD的發(fā)病機(jī)理也各有論述，如水飲客肺，《內(nèi)經(jīng)素問·逆調(diào)論》云“不得臥，臥則喘者，是水氣之客也”[14]；外邪客肺，巢元方提出“肺主于氣……為息奔上氣”[15]。肺脹與中氣，《柳選四家醫(yī)案》記載“咳而吐沫……中氣傷矣”[16]?？梢钥闯?，肺脹的發(fā)生，多因久病肺虛，痰濁潴留而致肺不斂降，氣還肺間，肺氣脹滿，每因復(fù)感外邪誘使病情發(fā)作或加劇。

痰熱清注射液由多味中草藥采用先進(jìn)的配制技術(shù)制成，組方具體包括黃芩、連翹、熊膽粉、金銀花、山羊角。配伍中黃芩為君藥，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)作用，F(xiàn)an等研究發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物可能參與抑制脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞下游炎癥因子的合成與釋放[17]。熊膽粉、山羊角為臣藥，具有緩解痙攣、消除炎癥、抗驚厥等作用，鄭億等研究發(fā)現(xiàn)，熊膽粉對小鼠體內(nèi)體外大腸埃希菌等多種細(xì)菌具有明顯的抑制作用[18]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)山羊角提取物對傷寒等病毒所致發(fā)熱的兔具有明顯解熱作用；金銀花與連翹配伍能夠抑制和殺滅多種病原微生物，《本草綱目》記載金銀花具有“久服輕身、延年益壽”之功，為“瘡家圣藥”。

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關(guān)蛋白，幾乎分布于所有的細(xì)胞系，主要表達(dá)在參與宿主防御功能的細(xì)胞，以骨髓單核細(xì)胞的表達(dá)最多[19]，其主要介導(dǎo)革蘭氏陰性菌表面的脂多糖（LPS）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過其信號途徑激活 NF-κB， 啟動 TNF-α、IL-8、IL-17的轉(zhuǎn)錄翻譯，激發(fā)炎癥因子的瀑布效應(yīng)[20]。如今關(guān)于TLRs參與天然免疫的的研究已達(dá)到一個新的水平，對TLRs傳導(dǎo)通路的深入研究可以更科學(xué)的了解機(jī)體天然免疫中的分子機(jī)制。但目前對于COPD發(fā)病機(jī)制中關(guān)于TLRs的研究多停留在動物模型水平，本研究旨在研究TLRs表達(dá)在COPD患者氣道炎癥過程的具體作用。

本研究以TLR4/NF-κB信號通路為靶點(diǎn)，觀察到使用痰熱清注射液治療后TNF-α、IL-8、IL-17均明顯降低，抑制炎癥因子表達(dá)。進(jìn)一步觀察到治療后TLR4、NF-κB表達(dá)下調(diào)，表明痰熱清注射液能夠直接抑制單核細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB活化，調(diào)控炎癥因子 TNF-α、IL-8、IL-17 轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用痰熱清注射液可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活減輕AECOPD患者炎癥反應(yīng)，本研究體現(xiàn)了中西醫(yī)聯(lián)合治療AECOPD的優(yōu)勢，為痰熱清注射液治療AECOPD提供了理論和試驗(yàn)依據(jù)，值得臨床推廣使用。