紅細(xì)胞溶血法用于體外評價日化產(chǎn)品和原料刺激性的研究

俞 婕 祝 愿 鮑紅潔

（納愛斯集團(tuán)有限公司，浙江麗水，323000）

兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)（Draize Eye Test）是評價化妝品、化學(xué)原料等刺激性大小的經(jīng)典方法。但該方法也有其不可避免的局限性，包括評分主觀性強(qiáng)，以及會對動物的眼睛造成傷害[1]。為了彌補(bǔ)這些不足，國內(nèi)外越來越多的機(jī)構(gòu)開始研究體外快速評價日化產(chǎn)品和原料刺激性的方法。

紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（Red Blood Cell Lysis Assay）就此應(yīng)運(yùn)而生，作為替代兔眼刺激性測試的體外方法之一，該方法具有快速、重復(fù)性好等優(yōu)勢。國內(nèi)外眾多實(shí)驗(yàn)室已開展對紅細(xì)胞溶血測試方法的建立及其代替眼刺激性實(shí)驗(yàn)的可行性研究，并且已經(jīng)積累了一定的研究經(jīng)驗(yàn)。不過，目前大部分的研究主要集中在該方法結(jié)果與兔眼刺激性結(jié)果的比較上[2-3]，或是對紅細(xì)胞溶血測試方法的機(jī)理研究上，而很少有機(jī)構(gòu)單純將該方法應(yīng)用于日化產(chǎn)品和原料的刺激性測評。

本研究旨在建立紅細(xì)胞溶血法快速評價和對比日化產(chǎn)品和原料的刺激性，為日化產(chǎn)品開發(fā)中的原料篩選、配方優(yōu)化等過程提供快捷、有效的體外評價方法。

1 材料與方法

1.1 樣品

選取27個日化產(chǎn)品以及表面活性劑原料作為紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)的測試樣品。其中樣品的PBS溶液應(yīng)為無色澄清且均勻的液體，溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免放置過久產(chǎn)生沉淀或分層。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

梅特勒ME3002E電子天平（精確至0.0001 g），湘儀H1850高速離心機(jī)，IKA KS400 ic控溫?fù)u床，Thermo Fisher全波長酶標(biāo)儀及配套96孔板，一恒HWS26型恒溫水浴鍋，Eppendorf移液器（1～10 mL，100～1000 μL，1～100 μL）。

1.2.2 試劑

無菌脫纖維綿羊血，購自索萊寶（Solarbio），4℃下保存，自生產(chǎn)之日起一個月內(nèi)使用。PBS緩沖液：NaCl 7.20 g，KH2PO40.76 g，Na2HPO4·12H2O 7.95 g，葡萄糖 1.80 g，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。SDS溶液：稱取適量十二烷基硫酸鈉（分析純），加蒸餾水配制成指定濃度。

1.3 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅細(xì)胞懸液的制備

將5 mL新鮮的無菌脫纖維綿羊血移入50 mL離心管中，加入40 mL 37℃水浴的PBS緩沖液，3800 r/min離心15 min[4]，小心移除上清液和白細(xì)胞層，再次加入PBS緩沖液并重復(fù)操作至少3次，直至上清液澄清透明。最后加入PBS緩沖液稀釋，使其在575 nm處的吸光度值約為2[4]，即可用于測試。

紅細(xì)胞懸液需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制當(dāng)天需置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，使用前需充分混勻紅細(xì)胞懸液，以避免紅細(xì)胞懸液上下層之間濃度不均勻。

1.3.2 全溶血對照組的選擇

有文獻(xiàn)報道將蒸餾水組作為全溶血對照組，而將SDS溶液作為陽性對照組[5]，也有報道將SDS溶液作為全溶血對照組[6]。由于全溶血對照組的數(shù)據(jù)直接影響到后續(xù)的結(jié)果統(tǒng)計和計算，本文對全溶血對照組進(jìn)行測試以備選擇。

分別將配置好的紅細(xì)胞懸液以1:1的比例與濃度分別為20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L的SDS溶液進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，并測量反應(yīng)終止后各測試組在560 nm處的吸光度值，根據(jù)結(jié)果判斷溶血情況。

1.3.3 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

選擇PBS緩沖液作為溶劑，將測試樣品配制成指定濃度，用100 mL容量瓶定容。濃度設(shè)計：預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)5個左右不同濃度點(diǎn)來確定HC50的濃度范圍。正式實(shí)驗(yàn)時根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置至少8個不同濃度，且至少要有兩個點(diǎn)覆蓋HC50附近相關(guān)濃度，以避免太多的無溶血和全溶血濃度。

將不同濃度測試樣品溶液與紅細(xì)胞懸液以1∶1體積混合，并于32℃，200 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩10 min。振蕩結(jié)束后10000 r/min離心1 min以終止反應(yīng)。小心吸取上清液200 μL于96孔板上（避免產(chǎn)生氣泡），用酶標(biāo)儀測試560 nm處的吸光度值，每管樣品3孔平行，剔除異常數(shù)據(jù)后取平均值。除測試樣品外，以PBS為自溶血對照組，并根據(jù)1.3.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇適宜的全溶血對照組。

1.3.4 評價方法

通過觀察和比較50%紅細(xì)胞發(fā)生溶血時的樣品濃度HC50來橫向比較測試樣品刺激性大小，HC50的數(shù)值越大，對應(yīng)樣品的刺激性越小，反之如果HC50的數(shù)值越小，則對應(yīng)樣品的刺激性越大。

HC50的計算：先計算樣品溶液每個濃度的溶血率，計算公式如下：

其中A1、A2、A3分別為測試樣品組、自溶血對照組、全溶血對照組在560 nm處的吸光度值。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，溶血率為縱坐標(biāo)作直線回歸，根據(jù)直線回歸方程計算導(dǎo)致50%紅細(xì)胞溶血時的樣品溶液濃度，即HC50值（單位mg/L表示），結(jié)果保留整數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 全溶血對照組的選擇

根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)判斷出當(dāng)SDS溶液濃度100 mg/L及以上時，紅細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到全溶血狀態(tài)。隨后對SDS溶液濃度梯度進(jìn)行細(xì)化（圖1），實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)SDS溶液的濃度≥50 mg/L時，560 nm處的吸光度值基本持平，說明此時紅細(xì)胞已達(dá)到全溶血狀態(tài)。根據(jù)此結(jié)果，并充分考慮實(shí)驗(yàn)批次之間的誤差，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)選取100 mg/L SDS溶液作為全溶血對照組。

2.2 日化產(chǎn)品的紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

圖1 不同濃度SDS溶液的紅細(xì)胞溶血結(jié)果

選擇了3類刺激性關(guān)注度較高的嬰幼兒日化產(chǎn)品進(jìn)行紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)，分別是嬰兒洗發(fā)泡泡、嬰兒洗發(fā)沐浴露、嬰幼兒洗衣液，每一類產(chǎn)品選取了4～6個配方進(jìn)行比較。通過HC50值可以看出，不同類型產(chǎn)品之間的刺激性整體存在差異，其中嬰兒洗發(fā)泡泡和嬰兒洗發(fā)沐浴露由于直接與嬰兒柔嫩的皮膚接觸，配方的刺激性整體比嬰幼兒洗衣液更低。同一類產(chǎn)品中，不同配方之間也能進(jìn)行刺激性大小的比較。更進(jìn)一步，在同一個配方中，比較了4種原料對配方的刺激性帶來的差異（洗發(fā)泡泡配方PP1（原料A-D）），其中選用原料A時配方的刺激性略大于其他3種原料。

2.3 表面活性劑的紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

選擇了12種日化產(chǎn)品中常用的表面活性劑原料進(jìn)行紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)。比較HC50值可以發(fā)現(xiàn)不同表面活性劑之間的刺激性大小存在差異，如月桂酰谷氨酸鈉的HC50值明顯大于其他表面活性劑，說明其刺激性較小。AES的HC50值最小，說明其刺激性相對較大。

2.4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了采用100 mg/L的SDS溶液作為全溶血對照組在紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)中的可行性。在對嬰幼兒日化產(chǎn)品的紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)中，通過比較各樣品的HC50值，能有效評價和對比不同品類日化產(chǎn)品的配方在刺激性大小方面的差異，也能區(qū)分和比較同一品類產(chǎn)品中不同配方之間的差異，還能為產(chǎn)品研發(fā)過程中的配方篩選和優(yōu)化提供有效的數(shù)據(jù)支持。在對表面活性劑原料的測試中，不同樣品之間的HC50值差異較為明顯，有一定的區(qū)分度，能夠?yàn)榕浞窖邪l(fā)過程中的原料選擇提供一定的參考。

3 討論

國內(nèi)外關(guān)于紅細(xì)胞溶血法的研究可追溯至30多年前[7]，雖然實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)過程基本一致，但各家機(jī)構(gòu)所采用的紅細(xì)胞種類、統(tǒng)計方法等實(shí)驗(yàn)條件各有不同，很難判斷出一個最優(yōu)的方案。對于評價血紅蛋白變性的計算方法而言，目前報道的就有2種[4,8]甚至更多，而且也沒有具體說明各計算方法的原理。因此，紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)?zāi)壳爸荒芨嗟貞?yīng)用于自身實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)。

表1 日化產(chǎn)品的紅細(xì)胞溶血結(jié)果

表2 表面活性劑原料的紅細(xì)胞溶血結(jié)果

對于紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)評價日化產(chǎn)品和原料的刺激性的方法，現(xiàn)有資料大多是測試并計算得出半數(shù)紅細(xì)胞溶血濃度HC50與血紅蛋白變性率HDR（或血紅蛋白變性指數(shù)DI）的比值H/D，根據(jù)比值對測試樣品進(jìn)行“無刺激、微弱刺激、輕度刺激、嚴(yán)重刺激”4個級別的評價。但在日化產(chǎn)品和表面活性劑原料的測試中，大部分的刺激性等級處于“無刺激性”或“輕度刺激性”水平，無法進(jìn)行更為細(xì)致地區(qū)分和比較，因而也無法給予產(chǎn)品開發(fā)過程中的表面活性劑原料篩選、配方橫向比較等提供有效的參考。而通過測試和比較樣品的HC50，既能夠區(qū)分相同刺激性等級下不同樣品之間細(xì)微的刺激性差異，也可以節(jié)省更多測試和計算時間，提高產(chǎn)品研發(fā)的效率。

當(dāng)然，紅細(xì)胞溶血法由于實(shí)驗(yàn)材料、計算方式等因素，也有著一定的局限性。一是對于帶有顏色或渾濁的樣品溶液會干擾最終的吸光度測試結(jié)果，此類產(chǎn)品或原料無法進(jìn)行準(zhǔn)確地測試。二是不同的紅細(xì)胞來源也會影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[9-11]，因此在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)最好選擇單一且穩(wěn)定的血液來源，以便對各批次測試結(jié)果進(jìn)行比較。另外，對于測試血液要求在自生產(chǎn)之日起的4周進(jìn)行使用，盡量不使用過期的血液產(chǎn)品，以避免血液的自溶血過高引起結(jié)果的變化。

研究還發(fā)現(xiàn)，日化產(chǎn)品或是表面活性劑原料的HC50值常常在較為狹窄的濃度區(qū)間內(nèi)產(chǎn)生突躍，此時可能需要經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)才能鎖定HC50的濃度范圍，再根據(jù)測試情況進(jìn)行濃度梯度設(shè)計。