ACSF2啟動子區(qū)c.-751 A>C突變影響揚州鵝產(chǎn)蛋性能作用機制研究

王秋實,汪琴,韋偉,張鑫寶,夏夢圓,張立凡,陳杰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

鵝的產(chǎn)蛋性能是重要經(jīng)濟性狀,提高鵝的產(chǎn)蛋能力對促進養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展、提高生產(chǎn)效益具有重要意義。ATP是細胞的主要能量“貨幣”,細胞內(nèi)ATP水平降低可導(dǎo)致包括細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)等在內(nèi)的多種細胞生物學(xué)過程紊亂[1-3]。顆粒細胞的能量代謝和線粒體功能對于卵泡發(fā)育和卵母細胞生長至關(guān)重要[4-7]。因此,顆粒細胞中線粒體ATP合成水平的高低是影響其細胞凋亡和進一步影響鵝產(chǎn)蛋性能的重要因素。

產(chǎn)蛋能力屬于低遺傳力性狀,開發(fā)有效的分子標(biāo)記并進行分子育種可以有效提高鵝的產(chǎn)蛋能力。本實驗室前期通過簡化基因組測序,篩選出多個與鵝產(chǎn)蛋性能相關(guān)的突變位點[8]。通過反向PCR,我們發(fā)現(xiàn)一個SNP Record-106582(rs1714766364)位于鵝?；o酶A合成酶家族成員2(ACSF2)基因起始密碼子上游751 bp(c.-751)處。ACSF2蛋白屬于酰基輔酶A合成酶(ACS)家族的成員,通過與輔酶A(CoA)形成硫酯鍵激活脂肪酸[9]。ACS能夠催化醋酸鹽、CoA和ATP生成乙酰輔酶A,參與脂肪酸和膽固醇合成、三羧酸循環(huán)等各種代謝途徑[10]。但是,目前有關(guān)ACSF2對顆粒細胞ATP合成活性及鵝產(chǎn)蛋性能影響的研究鮮有報道。

鑒于ACSF2在ATP合成中的潛在作用,本試驗在揚州鵝群體中驗證ACSF2突變位點與揚州鵝產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性,檢測該位點對基因表達活性的影響,探究ACSF2在顆粒細胞能量代謝過程中作用,以揭示ACSF2及其突變位點對鵝產(chǎn)蛋性能的影響,為揚州鵝的分子選育提供有效分子標(biāo)記,為鵝產(chǎn)蛋性能的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集及處理

343只揚州母鵝用于基因分型和產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)分析,其產(chǎn)蛋記錄均由江蘇立華牧業(yè)股份有限公司(江蘇)育種場提供。鵝的飼養(yǎng)條件按照該育種場種鵝飼養(yǎng)方法及飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進行:自由采食,白天在自然光照下室外散養(yǎng)。于產(chǎn)蛋末期,采集鵝翅靜脈全血,加檸檬酸葡萄糖抗凝,-20 ℃保存,用于鵝基因組DNA提取。

用于基因表達試驗的鵝組織樣品采集于產(chǎn)蛋高峰期,AA型和CC型母鵝各6只。鵝卵巢用液氮速凍及保存,用于后續(xù)RNA提取;采集卵泡顆粒細胞[11-12],用于基因功能研究等細胞生物學(xué)試驗。

1.2 卵巢和顆粒細胞中RNA的提取及cDNA合成

卵巢和顆粒細胞的總RNA采用Trizol試劑(Invitrogen,USA)提取,并且用DNaseⅠ(Invitrogen,USA)處理以防DNA污染。各RNA樣品由瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測質(zhì)量和濃度。采用ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit(NEB,北京)進行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系包含1 μg總RNA、2 μL d(T)23 VN primer(50 μmol·L-1)、10 μL M-Mulv reaction mix和2 μL M-Mulv enzyme mix,用無核酸酶水補齊至20 μL。反轉(zhuǎn)錄過程中,首先將總RNA、d(T)23 VN primer和無核酸酶水充分混勻,70 ℃變性5 min;短暫離心后立即置于冰上。向體系中加入M-Mulv reaction mix和M-Mulv enzyme混勻,42 ℃孵育1 h,80 ℃ 5 min。向反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入80 μL 無核酸酶水稀釋至100 μL,即可用于PCR反應(yīng)或-20 ℃保存。

1.3 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測卵巢和顆粒細胞中ACSF2和能量代謝相關(guān)基因的表達量

采用qPCR檢測AA和CC基因型個體卵巢中ACSF2基因的表達量,以及在顆粒細胞中過表達ACSF2后檢測ACSF2和能量代謝相關(guān)基因的表達量。各定量引物序列見表1。qPCR反應(yīng)試劑采用SYBR?Green Master Mix(Vazyme,南京),檢測儀器為StepOne Plus Real-Time PCR system(Applied Biosystems,USA)。PCR反應(yīng)體系(20 μL):2 μL cDNA,上游和下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,0.4 μL ROX Reference Dye,10 μL SYBR Green Master Mix和6.8 μL 無核酸酶水。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。從60 ℃上升至95 ℃每隔0.1 ℃讀板1次,獲取PCR產(chǎn)物熔解曲線。每個樣品重復(fù)測量3次。用GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT的方法計算基因相對表達水平。

1.4 基因分型和基因(型)頻率統(tǒng)計

采用等位基因特異PCR(AS-PCR)[13]對343只揚州鵝ACSF2基因c.-751 A>C位點進行基因型檢測。引物S1和S2的序列見表1,每對引物的上游引物為等位基因特異性引物,下游引物為通用引物。分型樣品為DNA,每個樣品的AS-PCR擴增體系均為20 μL,包括10 μL r-taq Mix、上游和下游引物各1 μL、1 μL DNA模板(50 ng·μL-1)和7 μL 無核酸酶水。PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,32個循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)由25 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)檢測。選取10個PCR產(chǎn)物送至測序公司(南京擎科生物科技有限公司)測序驗證。

1.5 ACSF2基因不同長度啟動子系列刪除載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中鵝ACSF2基因序列(NCBI ID:106034658),以鵝基因組DNA為模板,設(shè)計3對引物P2、P3、P4,分別擴增起始密碼子上游1 665、887、430 bp至起始密碼子下游75 bp的序列,得到3條含有ACSF2基因啟動子片段的PCR產(chǎn)物。每對引物兩端包括KpnⅠ和SmaⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點和保護堿基。具體引物序列見表1。PCR產(chǎn)物和pGL3-basic載體分別用KpnⅠ和SmaⅠ消化,產(chǎn)物經(jīng)切膠回收,然后將PCR酶切產(chǎn)物和pGL3-basic片段化載體連接、轉(zhuǎn)化,經(jīng)過菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定、測序驗證,最后獲得3個含有不同鵝ACSF2基因啟動子長度的熒光素酶報告基因載體,分別命名為pGL3-1665、pGL3-887、pGL3-430。

表1 本試驗用到的引物對列表Table 1 Primer pairs used in this study

1.6 不同基因型啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建

以c.-751 A>C SNP位點AA型個體基因組為模板,使用P3引物擴增獲得鵝ACSF2基因翻譯起始位點-887 bp至+75 bp、含SNP位點(c.-751 A>C)的一段長962 bp序列。利用KpnⅠ和SmaⅠ兩個酶切位點,構(gòu)建AA型熒光素酶報告基因載體pGL3-A。以pGL3-A載體為模板,以P5作為突變引物,利用點突變試劑盒Mut Express?Ⅱ Fast Mutagenesis Kit(Vazyme,南京),構(gòu)建SNP位點為C的突變載體pGL3-C。pGL3-A和pGL3-C均經(jīng)測序公司(南京擎科生物科技有限公司)測序驗證。

1.7 細胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性鑒定

將293T細胞以每孔2×104個細胞接種于十二孔板,培養(yǎng)24 h,至細胞匯合度達70%～80%時,進行熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染。利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(Invitrogen,USA)轉(zhuǎn)染含有啟動子片段的重組載體或pGL3-basic陰性對照質(zhì)粒1.5 μg、pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒0.03 μg。轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞,用于熒光素酶活性測定。測定試劑采用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega,USA)。重組載體上Firefly(螢火蟲)熒光素酶的發(fā)光值記為F,內(nèi)參基因的Renilla(海腎)熒光素酶發(fā)光值記為R,樣品F/R值即為啟動子的相對轉(zhuǎn)錄活性。

1.8 ACSF2基因過表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

以鵝卵巢RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,利用P6引物(兩端含有KpnⅠ和EcoRⅠ的限制性內(nèi)切酶酶切位點)擴增得到一段長度為1 791 bp的ACSF2CDS序列,酶切后連接至pcDNA3.1,構(gòu)建ACSF2過表達載體pcDNA3.1-ACSF2,并經(jīng)測序公司進行測序驗證。

鵝卵巢顆粒細胞以5×105mL-1接種于6孔板,培養(yǎng)24 h,至細胞匯合度達70%～80%,進行ACSF2過表達載體轉(zhuǎn)染。細胞分為2組,每組3個重復(fù):一組用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1,作為對照組;一組用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ACSF2,作為試驗組。轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞,用于RNA提取及ATP水平測定。

1.9 細胞ATP水平測定

使用碧云天ATP檢測試劑盒對細胞ATP水平進行檢測。檢測結(jié)果用總蛋白濃度進行校正,以消除樣品誤差。細胞總蛋白濃度測定利用增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進行測定。

1.10 ACSF2基因的生物信息學(xué)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載鵝ACSF2基因組信息,通過核心啟動子區(qū)在線預(yù)測軟件Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測ACSF2基因的核心啟動子區(qū)域。

1.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

基因型頻率(P)和基因頻率(p)計算公式如下:

Pii=Nii/N,Pij=Nij/N,Pjj=Njj/N,

pi=(2Nii+Nij)/2N,pj=(2Njj+Nij)/2N,

式中:Pii、Pij、Pjj分別為基因型ii、ij、jj個體的基因型頻率;pi為i基因的基因頻率;pj為j基因的基因頻率;i、j為某基因座上共同控制某一性狀的1對等位基因;Nii、Nij、Njj分別為基因型ii、ij和jj的個體數(shù);N為群體總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACSF2 c.-751 A>C位點在揚州鵝群體中的基因分型及基因頻率的統(tǒng)計

通過AS-PCR,我們以血液DNA為樣本,對343只揚州鵝的ACSF2c.-751 A>C位點進行基因分型,結(jié)果檢測到3種基因型:AA、AC和CC型(圖1-A)。為了驗證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性,本試驗分別選擇AA、AC和CC基因型個體DNA的擴增產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果(圖1-B)與AS-PCR判定結(jié)果一致。

圖1 SNP c.-751 A>C的等位基因特異PCR(AS-PCR)分型結(jié)果Fig.1 The results of allele specific PCR(AS-PCR) for SNP c.-751 A>CA. 部分樣品的AS-PCR分型結(jié)果The result of AS-PCR genotyping;B. 3種基因型的測序峰圖The sequencing result of three kinds of genotypes.

根據(jù)AS-PCR分型結(jié)果,揚州鵝群體的基因頻率及基因型頻率統(tǒng)計見表2。AC基因型頻率最高,AA基因型頻率次之,CC基因型頻率最低。

表2 ACSF2 c.-751 A>C基因及基因型頻率Table 2 Gene and genotype frequency of ACSF2 c.-751 A>C

2.2 ACSF2 c.-751 A>C與各基因型個體產(chǎn)蛋量相關(guān)性分析

將343只產(chǎn)蛋母鵝ACSF2c.-751 A>C位點的基因型與其34周產(chǎn)蛋量進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示,AA基因型產(chǎn)蛋量均值為81.40枚,AC基因型個體的平均產(chǎn)蛋量為77.91枚,CC基因型的平均產(chǎn)蛋量為72.69枚。AA基因型個體的平均產(chǎn)蛋量與CC基因型個體的平均產(chǎn)蛋量差異顯著(P<0.05),AA與AC基因型間產(chǎn)蛋量差異不顯著(表3)。

表3 揚州鵝ACSF2 c.-751 A>C位點不同基因型個體的34周產(chǎn)蛋量Table 3 Laying performance of Yangzhou goose with different genotypes on ACSF2 c.-751 A>C site

2.3 ACSF2基因在不同基因型個體卵巢中的差異表達

選取6個AA型和CC型個體,采用qPCR對其卵巢中ACSF2mRNA表達水平進行檢測。結(jié)果顯示(圖2),AA基因型個體卵巢組織中ACSF2mRNA的相對表達量顯著低于CC基因型個體(P<0.01)。

圖2 ACSF2基因在不同基因型鵝個體卵巢組織中的表達(n=6)Fig.2 The mRNA expression level of ACSF2 gene in the ovary of geese between different genotypes*P<0.05, **P<0.01. The same as follows.

2.4 過表達ACSF2基因?qū)Z顆粒細胞能量代謝途徑的影響

qPCR試驗結(jié)果顯示:在鵝顆粒細胞中轉(zhuǎn)入ACSF2基因過表達載體24 h后,ACSF2mRNA的表達水平顯著高于空載體pcDNA3.1對照組(圖3-A),表明該載體具有較高的過表達效率。ACSF2基因過表達后,顆粒細胞內(nèi)的ATP水平顯著升高(圖3-B)。ACSF2基因過表達以后糖代謝標(biāo)志基因檸檬酸合酶基因(CS)表達量顯著降低,異檸檬酸脫氫酶3α基因(IDH3A)表達量顯著升高,氧化磷酸化標(biāo)志基因ATP合酶F1亞基α基因(ATP5F1α)和琥珀酸脫氫酶復(fù)合物鐵硫亞基B基因(SDHB)表達水平顯著升高(P<0.05),而NADH脫氫酶亞單位-1基因(ND-1)和細胞色素c氧化酶第1亞基基因(COX1)表達量沒有顯著變化(圖3-B)。以上結(jié)果表明,ACSF2可以通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化途徑影響顆粒細胞內(nèi)的ATP水平。

圖3 ACSF2基因的過表達對鵝顆粒細胞能量代謝途徑的影響(n=3)Fig.3 ACSF2 affected energy metabolism in the granulosa cells of goose from follicles(n=3)分別轉(zhuǎn)染ACSF2過表達載體(pcDNA3.1-ACSF2)和pcDNA3.1空載體24 h后,顆粒細胞中ACSF2 mRNA的表達量(A)、ATP水平(B)和能量代謝相關(guān)基因mRNA的表達量(C)。The mRNA relative expression level of ACSF2(A),the ATP levels(B),and the mRNA relative expression level of energy metabolism related genes(C)in granulosa cells of Yangzhou goose after respectively transfected with pcDNA3.1-ACSF2 and pcDNA3.1 plasmid for 24 h.

2.5 ACSF2基因啟動子區(qū)的活性鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得鵝ACSF2基因的基因組序列,通過核心啟動子區(qū)域預(yù)測網(wǎng)站Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測ACSF2基因的核心啟動子區(qū)域,結(jié)果顯示TATA BOX位于ACSF2翻譯起始位點ATG上游的1 300 bp和800 bp附近。據(jù)此對其啟動子區(qū)進行分段擴增。設(shè)計引物,以AA基因型個體DNA為模板,擴增鵝ACSF2啟動子區(qū)-1665～+75 bp、-887～+75 bp、-430～+75 bp 3段序列,構(gòu)建ACSF2基因啟動子系列,刪除載體pGL3-1665、pGL3-887和pGL3-430(圖4-A)。

pGL3-1665、pGL3-887、pGL3-430分別與pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細胞,同時共轉(zhuǎn)染pGL3-basic與pRL-TK作為陰性對照組。熒光素酶活性分析結(jié)果(圖4-B)顯示:pGL3-430相對熒光活性顯著高于陰性對照,約12倍(P<0.01);pGL3-887比pGL3-430顯著降低(P<0.01),pGL3-1665比pGL3-887稍低,但是相對熒光素酶活性差異不顯著。這些結(jié)果表明ACSF2基因核心啟動子區(qū)位于-1～-430 bp,而-430～-887 bp可能存在沉默子的結(jié)合位點。

圖4 ACSF2基因不同長度啟動子的熒光素酶報告基因載體(A)和活性分析(B)(n=3)Fig.4 The diagram(A)and activity analysis(B)of the luciferase reporter gene vector with different lengths of ACSF2 gene promoter

2.6 ACSF2基因不同基因型啟動子活性分析

構(gòu)建了ACSF2 c.-751A>C位點為AA型和CC型的熒光素酶報告載體pGL3-A和pGL3-C(圖5-A),再將2個不同基因型的熒光素酶報告載體pGL3-A和pGL3-C分別轉(zhuǎn)染293T細胞,培養(yǎng)24 h后檢測其熒光素酶活性。結(jié)果表明(圖5-B):載體pGL3-A(AA型)的啟動子活性顯著低于pGL3-C(CC型)的啟動子活性(P<0.01),說明該位點的突變能夠影響ACSF2基因的啟動子活性。

圖5 pGL3-A和pGL3-C兩種基因型啟動子載體的測序驗證(A)和在293T細胞中的活性分析(B)(n=3)Fig.5 Sequencing verification(A)and transcription activity analysis(B)of the pGL3-A and pGL3-C vectors in 293T cells

3 討論

鵝的產(chǎn)蛋能力屬于低遺傳力性狀,開發(fā)有效的分子標(biāo)記進行分子育種可以有效提高鵝的產(chǎn)蛋能力。目前已發(fā)現(xiàn)一些SNP與鵝的產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān),如在催乳素受體基因(PRL)的5′端調(diào)控序列發(fā)現(xiàn)3個SNP與皖西白鵝產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān),在促性腺激素釋放激素基因(GnRH)5′調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)3個SNP與皖西白鵝產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān)[14],在促卵泡激素基因(FSHβ)的第3外顯子有與皖西白鵝和萊茵鵝產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān)的SNP[15],在促性腺激素抑制激素基因(GnIH)的內(nèi)含子和外顯子上發(fā)現(xiàn)與四川白鵝產(chǎn)蛋性能相關(guān)的SNP[16]。多個分子標(biāo)記的綜合應(yīng)用將有助于提高鵝的產(chǎn)蛋性能,產(chǎn)蛋相關(guān)的分子標(biāo)記還有待進一步發(fā)掘,其作用機制也有待進一步闡明。

本實驗室前期通過簡化基因組測序篩選與揚州鵝產(chǎn)蛋性能相關(guān)的突變位點[8],并對關(guān)鍵候選SNP進行深入研究,發(fā)現(xiàn)位于MAGI1內(nèi)含子的SNP影響該基因的表達量,進而通過調(diào)節(jié)顆粒細胞的凋亡影響揚州鵝產(chǎn)蛋性能[17];在KIAA1462啟動子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)存在完全連鎖的SNP,能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子GR對KIAA1462啟動子的結(jié)合活性,調(diào)節(jié)該基因的表達量和顆粒細胞凋亡,調(diào)控揚州鵝產(chǎn)蛋性能[18]。本試驗針對位于ACSF2基因翻譯起始位點上游751 bp的SNP Record-106582(rs1714766364),即c.-751 A>C變異進行進一步驗證,即驗證該SNP位點在揚州鵝群體中與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性,結(jié)果顯示AA基因型個體的平均產(chǎn)蛋量均顯著高于CC基因型個體。由此可見,在鵝的選育工作中可以通過人為選擇AA基因型個體提高A等位基因頻率,降低C等位基因的頻率,來提高鵝群體的平均產(chǎn)蛋性能。

由于c.-751 A>C突變影響卵巢組織中ACSF2基因的mRNA相對表達量,且位于ACSF2啟動子區(qū),我們推測該突變通過調(diào)節(jié)啟動子的活性從而發(fā)揮作用。熒光素酶相對活性表明ACSF2核心啟動子區(qū)位于 -1～-430 bp,在-430～-887 bp可能存在一個負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。而c.-751 A>C恰好落在 -430～-887 bp區(qū)間。因此,結(jié)合AA型啟動子活性顯著低于CC型、以及AA型個體卵巢組織中ACSF2基因表達顯著低于CC型的試驗結(jié)果,本研究可得出結(jié)論:c.-751 A突變?yōu)镃以后,-430～-887 bp區(qū)域沉默子的作用減弱,啟動子活性增強,ACSF2基因表達量上升。

上述研究結(jié)果確認了SNP位點對ACSF2基因表達量的影響,ACSF2在鵝產(chǎn)蛋性能的作用是我們關(guān)注的下一目標(biāo)。ACSF2是乙酰輔酶A合成酶ACS家族中的一員。ACS催化醋酸鹽、CoA和ATP生成乙酰輔酶A,參與脂肪酸和膽固醇合成、三羧酸循環(huán)等各種代謝途徑[10],增加ATP的釋放[19]。已有研究表明,ACS家族成員ACS-4能夠通過MAPK通路調(diào)節(jié)脂肪酸的水平,從而調(diào)控動物的生殖發(fā)育[20]。而ACSF2作為線粒體基質(zhì)酶的一員,能夠參與線粒體的運作,影響線粒體的功能。研究表明線粒體功能與卵泡發(fā)育[4]以及卵母細胞的生長有著密切關(guān)系[6]。生發(fā)泡期卵母細胞中線粒體功能失調(diào),氧化磷酸化和ATP生成相關(guān)基因表達發(fā)生變化,可能是導(dǎo)致卵巢老化、繁殖機能下降的重要原因[21]。因此,添加AMP[22]、CoQ10[23]、acetyl-L-carnitine[24]和Melatonin[25]等可以促進線粒體功能和ATP水平恢復(fù)正常,促進卵母細胞的體外成熟,有助于提高人和綿羊、牛、水牛等動物的繁殖性能。本研究結(jié)果表明,過表達ACSF2促進ATP濃度顯著升高,這與ACSF2過表達以后釀酒酵母ATP水平顯著升高的結(jié)果一致[26];由于糖代謝標(biāo)志基因異檸檬酸脫氫酶3α(IDH3A)基因表達量顯著升高,氧化磷酸化標(biāo)志基因ATP合酶F1亞基α基因(ATP5F1α)和琥珀酸脫氫酶復(fù)合物鐵硫亞基B基因(SDHB)表達水平也顯著升高,我們推測ACSF2可以通過促進三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化途徑提高顆粒細胞內(nèi)的ATP水平。檸檬酸合酶(CS)基因表達量顯著降低,可能是由于三羧酸循環(huán)被激活后,檸檬酸合酶產(chǎn)物增多,對檸檬酸合酶活性產(chǎn)生抑制作用導(dǎo)致的。

Alonso-Pozos等[27]的研究表明能量代謝可以引起顆粒細胞凋亡。也有研究報道高濃度的ATP可以激活Caspase-3,導(dǎo)致人顆粒黃體細胞的凋亡[28]。線粒體在人顆粒黃體細胞的細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,ATP是細胞程序性死亡的誘因,也是啟動細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的必要成分[29]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)ACSF2影響顆粒細胞的Caspase-3表達水平[30]。以上結(jié)果表明ACSF2能夠影響鵝顆粒細胞的能量代謝途徑,促進顆粒細胞凋亡,進而影響揚州鵝的產(chǎn)蛋量。

總之,本研究表明ACSF2啟動子區(qū)c.-751 A>C突變能夠改變該基因的轉(zhuǎn)錄活性,通過改變細胞中能量代謝水平影響顆粒細胞凋亡,從而對鵝的產(chǎn)蛋性能產(chǎn)生影響。該突變位點有望成為揚州鵝產(chǎn)蛋性能選育的分子標(biāo)記。

致謝:感謝江蘇立華牧業(yè)股份有限公司為本研究提供揚州鵝的血液、卵巢樣品和產(chǎn)蛋記錄。