自體骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥治療慢性肝功能衰竭的研究

孔祥建

研究應(yīng)用患者自體骨髓干細(xì)胞作為供體，在體外分離純化后移植至患者體內(nèi)，使干細(xì)胞在肝臟中生長(zhǎng)分化為具有功能的肝細(xì)胞［1-5］，使損傷的肝功能得以恢復(fù)和重構(gòu)，為干細(xì)胞的進(jìn)一步治療研究打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 160例慢性乙型重型肝炎為我院住院患者，年齡22～68歲;診斷符合2000年病毒性肝炎防治方案診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。隨機(jī)分組120例患者行自體骨髓干細(xì)胞移植治療，40例患者作為對(duì)照，給予綜合基礎(chǔ)治療。所有治療患者在知情同意的情況下，簽定《知情同意書》，兩組基本情況均無顯著性差異。

1.2 排除病例 肝性腦病、消化道出血、重度感染或大量腹水等嚴(yán)重并發(fā)癥，半年內(nèi)未使用過其他抗病毒藥和其他免疫調(diào)節(jié)劑。其他病毒感染、酒精性、藥物性肝病。

1.3 主要試劑及儀器 超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)：臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Heraeus公司);二氧化碳孵箱(美國(guó)Heraeus公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司)流式細(xì)胞儀(FACSCalrbur，美國(guó)BD公司)LCVPLUS血管造影儀(美國(guó)GE公司)。Percoll分離液(美國(guó)Sigma公司);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)。

1.4 骨髓干細(xì)胞的采集 患者行局部麻醉消毒，在無菌條件下，以18號(hào)骨髓穿刺針從髂后上棘進(jìn)行穿刺，抽取骨髓50～10 ml，以4000 U肝素抗凝，避免污染。

1.5 骨髓干細(xì)胞的分離 參照文獻(xiàn)［7］的方法，患者骨髓離心去除脂肪層，用等量DMEM培養(yǎng)液稀釋骨髓，制成細(xì)胞懸液。將骨髓輕輕的加到密度1.073/ml的percoll分離液上，在室溫下1200r/min，離心25 min。吸取界面細(xì)胞層，用等滲鹽水洗脫，1500 r/min×5 min離心3次，等滲鹽水重懸細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)所用細(xì)胞為1.0×107個(gè)ml，制成體積為10 ml懸液，置于37℃二氧化碳孵箱待用。

1.6 骨髓干細(xì)胞移植 患者在局部麻醉下，行肝動(dòng)脈介入，在X線監(jiān)視下，將分離的骨髓干細(xì)胞5×108～5×109/ml。通過導(dǎo)管從肝動(dòng)脈緩慢給入病變部位。之后用10 ml等滲鹽水沖洗管腔。

1.7 口服中藥 大黃、蟄蟲、大腹皮、牛膝、莪術(shù)、三棱、檳榔、雞內(nèi)金、桃仁、醋芫花、水蛭、虎杖、黃芩、甘草、黃芪、丹參、茵陳等隨證加減［8］。

1.8 肝功能檢查 對(duì)照組和移植組患者在移植后1、4、8、12周進(jìn)行肝功能檢測(cè)，分別檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，總膽紅素(Tbil)，白蛋白(Alb)，凝血酶原活動(dòng)度(PTA)等指標(biāo)。在 1、4、8、12 周觀察腹水，食欲，體力，腹脹，睡眠等癥狀改善情況，及術(shù)后的不良反應(yīng)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 自體骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥后患者肝功能的改變 自體骨髓干細(xì)胞移植后患者肝功能在移植1、4、8、12周后，肝功能明顯改善，和對(duì)照組相比有明顯差異，表明骨髓干細(xì)胞移植治療后，患者肝功能逐步改善，見表1。

表1 自體骨髓干細(xì)胞移植后肝功能改善()

表1 自體骨髓干細(xì)胞移植后肝功能改善()

注：ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;Tbil：總膽紅素;Alb：白蛋白;與未移植對(duì)照組比較，*t=4.82，P ＜0.05，#t=4.31，P ＜0.05，△t=5.39，P ＜0.05。

組別 ALT(U/L) Tbil(μmol/L) Alb(g/L)133.8±18.5 131.8±15.9 28.9±3.8移植組 136.5±11.7 121.9±11.1 28.1±3.9對(duì)照組 術(shù)后1周 132.7±22.1 133.1±19.3 27.9±4.1移植組 128.2±20.5 119.3±11.5 29.8±3.9對(duì)照組 術(shù)后4周 104.8±18.6 122.7±12.9 28.1±3.6移植組 115.3±13.3 112.5±11.3 30.9±34對(duì)照組 術(shù)后8周 091.4±20.80 114.3±12.5 29.0±3.5移植組 084.8±14.9 082.7±21.7 32.5±3.8對(duì)照組 術(shù)后12周 082.9±21.10 106.5±12.1 28.2±3.6移植組 068.5±12.6* 081.6±41.8# 32.5±3.5對(duì)照組 術(shù) 前△

2.2 自體骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥后患者凝血機(jī)制的改變：移植組在干細(xì)胞移植后PTA逐漸上升，由術(shù)前平均25.9%上升至術(shù)后12周的52.6%;而對(duì)照組患者沒有明顯改善，表明骨髓干細(xì)胞移植治療后，患者凝血機(jī)制有所改善。

2.3 自體骨髓干細(xì)胞移植對(duì)患者短期生存率的改變 患者在移植后1周的生存率為100%，在4周內(nèi)死亡2例，生存率為98.0%：在12周內(nèi)死亡6例，生存率95.0%。為移植患者在1周后，生存率下降至86.7%;4周后降至80.0%;12周后降至60.0%

2.4 自體骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥后患者癥狀的改善 移植后大多數(shù)患者有明顯的癥狀改善，移植后食欲改善者90例，體力好轉(zhuǎn)者64例，腹脹減輕者56例，興奮失眠18例，局部疼痛6例。

2.5 自體骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥后不良反應(yīng)的發(fā)生情況 在120例移植患者中未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，術(shù)后有輕度惡心6例，發(fā)熱8例。未見其他嚴(yán)重不良反應(yīng)。

3 討論

干細(xì)胞分化為具有功能的組織細(xì)胞并應(yīng)用于器官損傷的治療，是人們關(guān)注的熱點(diǎn)及追求的目標(biāo)。研究表明，在肝損傷中，干細(xì)胞起著重要的作用，骨髓干細(xì)胞是肝細(xì)胞的重要肝外來源［9］，在特定環(huán)境下可分化成肝干細(xì)胞和肝細(xì)胞，參與肝功能的修復(fù)和重構(gòu)［10］從而治療肝損傷，為探索骨髓干細(xì)胞在人類肝損傷的治療作用，本文在大量研究的基礎(chǔ)上，采用患者自體骨髓干細(xì)胞作為供體，在體外分離純化后移植患者至患者肝臟，使其在自身內(nèi)環(huán)境下分化為肝細(xì)胞，替代損傷的肝細(xì)胞。觀察骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥［11］使損傷的肝功能得以恢復(fù)和重構(gòu)。又可以避免免疫排斥反應(yīng)，不必考慮組織相容性抗原的配型問題，具有良好應(yīng)用前景。

研究發(fā)現(xiàn)患者在移植12周后，ATL逐漸降低，由平均136.5U/L降至68.5U/L;Tbil由平均121.9 μmol/L降至81.6 μmol/L;Alb逐漸升高，由平均28.1 g/L升至32.5 g/L;和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明骨髓干細(xì)胞移植治療后，患者肝功能明顯改善;移植組在干細(xì)胞移植后PTA逐漸上升，由術(shù)前平均25.9%上升術(shù)后8周的52.6%;表明骨髓干細(xì)胞移植治療后，患者凝血機(jī)制明顯改善。生存率移植組較對(duì)照組明顯升高。自體骨髓干細(xì)胞移植后大多數(shù)患者有明顯的癥狀改善，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。

本文中，初步探討了自體骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥治療對(duì)肝衰竭的療效可佳。但是，以后將對(duì)移植分化的細(xì)胞進(jìn)行追蹤檢測(cè)，探討移植后自體骨髓干細(xì)胞在人受體肝臟內(nèi)定植、生長(zhǎng)分化為肝細(xì)胞的過程采用自體骨髓干細(xì)胞移植結(jié)合口服中藥治療肝衰竭，療效可佳，不存在免疫排斥反應(yīng)，安全有效，價(jià)格低廉，具有良好前景。研究將為肝病治療打開嶄新途徑，為干細(xì)胞的進(jìn)一步治療研究打下基礎(chǔ)。

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