初探分化型甲狀腺癌外周血中PD-1、TIGIT、Tim-3表達水平與臨床特征的關(guān)系

常 誠，馮亞寧，王新華

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1核醫(yī)學科， 2新疆腫瘤學重點實驗室，烏魯木齊 830011； 3中國醫(yī)學科學院腫瘤免疫與放療研究重點實驗室，4新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室， 烏魯木齊 830011)

甲狀腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐漸增加的趨勢。其病理類型主要由乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌及未分化癌組成。臨床上甲狀腺乳頭狀癌的患者往往通過手術(shù)切除甲狀腺后根據(jù)患者術(shù)后復發(fā)危險分層這一系統(tǒng)進一步指導患者是否行放射性I131治療，但仍然有部分難治性甲狀腺癌患者經(jīng)手術(shù)及I131治療后其預后依然不佳[1]。免疫檢查點(checkpoint)是指在免疫細胞上表達、能調(diào)節(jié)免疫應答激活程度的一系列分子，在抗腫瘤免疫中起著重要的作用。關(guān)于免疫檢查點中程序性死亡受體1(programmed death-1，PD-1)、含T細胞免疫球蛋白域和免疫受體酪氨酸抑制基序的蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)及T 淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白3(T lymphocyte immune globulinmucin-3，Tim-3)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸成為近年來研究的熱點[2-4]。如果能針對免疫檢查點分子進行調(diào)節(jié)，比如以PD-1、PD-L1靶向藥物為代表的免疫抑制劑就可以發(fā)揮增強機體免疫功能的作用，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞的功效[5]。免疫治療在臨床應用中雖然表現(xiàn)出顯著而持久的療效，卻只有少數(shù)患者受益，客觀有效率僅有10%～40%[6-7]，多項回顧性及前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)放射治療聯(lián)合免疫治療可以顯著的提高腫瘤的局部控制率及有效的延長患者的疾病無進展生存時間[8-9]。結(jié)合以上研究發(fā)現(xiàn)，是否可通過免疫抑制劑治療聯(lián)合131碘同位素治療難治性甲狀腺癌術(shù)后的患者，以提高這部分患者的局部控制率及遠期生存率。因此，本研究以術(shù)后需接受131碘治療的分化型甲狀腺癌患者為研究對象，探索外周血T細胞PD-1、TIGIT及Tim-3受體表達水平與臨床病理特征之間的相關(guān)性。為后續(xù)進一步開展免疫治療聯(lián)合131碘同位素治療的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年11月-2020年1月于新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的，根據(jù)《2018年甲狀腺癌診療規(guī)范》[10]術(shù)后需接受131碘同位素治療的32例患者作為患者組。平均年齡(43±9)歲，男性13例，女性19例。同時按年齡、性別進行匹配收集27例在本院進行健康體檢的受檢者作為對照組。納入標準：患者病歷資料齊全；病理結(jié)果均提示為甲狀腺乳頭狀癌；術(shù)后需接受131碘同位素治療的患者。排除標準：排除病歷資料不完整的患者；合并其他原發(fā)惡性腫瘤的患者；既往接受過免疫治療的患者；有免疫系統(tǒng)疾病及合并嚴重的基礎(chǔ)疾病患者。兩組對象年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學意義。所有受試者在實驗開始前均被告知臨床研究的目的、方法，預期效益和可能的潛在風險，并自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法抽取晨起空腹外周EDTA抗凝靜脈血，離心處理后，采取密度梯度離心法分離外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。向分離提取的PBMCs加入Live/Dead染料(themo fisher scientific)，置于4℃冰箱中染色20～30 min，隨即FACS washing buffer洗滌2次，加入針對表面抗原的熒光標記抗體：CD3-BUV396、CD4-PE、CD8-PerCP-Cy5.5、PD-1-Bv650、TIGIT-APC-R700、Tim-3-BB515。再次4℃冰箱染色后，使用BD LSR Fortessa流式細胞分析儀(BD Biosciences)進行檢測。檢測獲得的資料采用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)化處理。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌患者與健康人群外周血T細胞亞群上免疫檢查點表達水平的比較對照組外周血中CD4+T細胞及CD8+T細胞上PD-1及Tim-3的表達水平均低于患者組，組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組外周血中CD4+T細胞及CD8+T細胞上TIGIT表達均高于患者組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、2，圖1、2。

表1 健康人群與甲狀腺乳頭狀癌患者外周血CD4+T細胞上抑制性受體的表達水平比較

表2 健康人群與甲狀腺乳頭狀癌患者外周血CD4+T細胞上抑制性受體的表達水平比較

圖1 甲狀腺癌患者外周血中T細胞亞群上免疫檢查點的表達

圖2 對照組外周血T細胞亞群上免疫檢查點表達水平的比較

2.3 甲狀腺癌患者外周血中T細胞亞群上免疫檢查點的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系外周血CD4+T細胞上PD-1的表達與BMI有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小、局部侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、有無合并甲狀腺良性疾病等因素無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，同樣按上述這些因素分組研究時，尚未發(fā)現(xiàn)外周血中CD4+T細胞上TIGIT及Tim-3的表達與這些因素有關(guān)。見表3。

表3 免疫檢查點在甲狀腺乳頭狀癌患者外周血CD4+T細胞上的表達與臨床特征之間的關(guān)系

表4 免疫檢查點在甲狀腺乳頭狀癌患者外周血CD8+T細胞上的表達與臨床特征之間的關(guān)系

2.4 BRAF基因突變的甲狀腺癌患者外周血T細胞上免疫檢查點表達水平與臨床特征之間的關(guān)系自甲狀腺癌患者組中遴選出BRAF基因突變的患者17例。提示BRAF基因突變的甲狀腺癌患者外周血中CD4+T細胞上免疫檢查點的表達與年齡、BMI、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)及有無甲狀腺合并癥等因素無關(guān)；而PD-1在BMI異?；颊咄庵苎狢D8+T細胞上的表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TIGIT和Tim-3在BRAF基因突變合并甲狀腺良性疾病的患者外周血CD8+T細胞上的表達較BRAF基因突變未合并甲狀腺良性疾病的患者高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時Tim-3的表達水平在年齡較小者組中表達較高，差異有統(tǒng)計學意義(表5)。

表5 BRAF基因突變患者外周血免疫檢查點的表達與臨床特征之間的關(guān)系

3 討論

由于腫瘤的免疫治療涉及復雜的免疫機制，也是近年來眾多腫瘤相關(guān)研究的熱點，PD-1參與人體免疫調(diào)節(jié)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究的結(jié)果顯示術(shù)后甲狀腺乳頭狀癌患者CD8+PD-1+T細胞和CD4+PD-1+T細胞比例均高于對照組，這與Chowdhury S等的研究相仿[11]。T細胞在腫瘤的免疫應答中具有至關(guān)重要的作用，主要由CD4+和CD8+T細胞組成，CD8+T細胞活化后能夠特異的殺傷靶細胞，在免疫清除中發(fā)揮重要的作用。當PD-1與配體結(jié)合后，CD8+PD-1+T細胞受體胞漿區(qū)C端的免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化序列招募并激活蛋白酪氨酸磷酸酶-1及蛋白酪氨酸磷酸酶-2，使其發(fā)生磷酸化，并導致 PTEN 磷酸酶的活性升高，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)的激活受到抑制，進一步抑制了磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-AKT)信號通路的傳遞[12]，最終導致CD8+PD-1+T活性降低，CD8+T細胞的免疫清除作用減弱，導致腫瘤的侵襲性增強，進而解釋了本研究中術(shù)后甲狀腺乳頭狀癌患者CD8+PD-1+T細胞比例顯著高于健康對照組的原因。CD4+T細胞主要由調(diào)節(jié)性CD4+T細胞及輔助性CD4+T細胞組成。調(diào)節(jié)性CD4+T細胞主要通過抗原依賴的方式抑制輔助性CD4+T細胞的活化，通過降低免疫反應的方式維持自身的耐受，研究發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細胞表面的受體PD-1與配體結(jié)合時，可以促進CD4+ PD-1 T向調(diào)節(jié)性CD4+T細胞轉(zhuǎn)化，最終導致循環(huán)中調(diào)節(jié)性CD4+T細胞數(shù)量增加，從而降低外周免疫系統(tǒng)反應，導致人體免疫系統(tǒng)不能通過有效的免疫應答消除腫瘤細胞，這也與本研究中甲狀腺癌患者CD4+ PD-1 T顯著高于健康對照組的結(jié)果相吻合。

TIGIT是近年來免疫抑制機制研究的熱點受體之一。TIGIT定位于T細胞和NK 細胞細胞膜上，包含一個 ITT-like結(jié)構(gòu)域和一個經(jīng)典的 ITIM 結(jié)構(gòu)域，配體與受體結(jié)合后，發(fā)揮負性調(diào)節(jié)T細胞、NK細胞的功能[13]，研究顯示，肺鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等浸潤性CD8+ T 細胞表面 TIGIT 表達上調(diào)[14-15]。但本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后甲狀腺乳頭狀癌的患者外周血CD8+TIGIT+T細胞和CD4+TIGIT+T細胞的百分比例均低于正常對照組。 Kong等[16]曾報道在急性髓性白血病病人中TIGIT 高表達，與難治療和復發(fā)等臨床不良結(jié)果相關(guān)聯(lián)。提示在預后較差的惡性腫瘤患者群體中，TIGIT呈高表達狀態(tài)。因此，對于預后相對較好的甲狀腺癌，推測TIGIT的低表達可能與甲狀腺癌預后較好有關(guān)。另外，本研究收集的標本為術(shù)后外周血，也可能與術(shù)后患者免疫狀態(tài)逐漸恢復有關(guān)。因此，有必要進一步擴大樣本，深入研究甲狀腺乳頭狀癌術(shù)前與術(shù)后外周血內(nèi)、以及甲狀腺癌組織、癌旁組織T淋巴細胞TIGIT的表達差異。

Tim-3由免疫球蛋白V區(qū)(IgV區(qū))、粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段組成。研究發(fā)現(xiàn)Tim-3 與配體 Gal-9 相結(jié)合后，引起Tim-3的酪氨酸殘基(Y256 和 Y263)發(fā)生磷酸化，導致原本與Tim-3緊密結(jié)合的Bat-3因子從細胞內(nèi)段釋放出來，隨之含有Scr 激酶活性的SH-2結(jié)構(gòu)域與Tim-3相結(jié)合，發(fā)揮負向調(diào)控T細胞受體信號功能，最終導致T細胞的凋亡和衰竭[17]。本研究在甲狀腺乳頭狀癌患者外周血中檢測到CD4+和CD8+T細胞均高表達Tim-3受體，而在白血病、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中也同樣證實Tim-3+ T細胞的高表達于腫瘤的進展有關(guān)[18-20]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在基因突變的肺癌模型中，進行抗PD-1治療產(chǎn)生耐藥性的小鼠T淋巴細胞高表達Tim-3受體，當聯(lián)合抗PD-1和抗Tim-3抗體后，可顯著降低小鼠抗PD-1耐藥的比例，提示Tim-3在腫瘤的免疫治療中可能是具有潛在意義的新的靶點。

Leitzmann等[21]認為BMI與甲狀腺癌之間存在正相關(guān)，肥胖人群甲狀腺癌的患病風險與正常體質(zhì)量人群相比增加40%，尤其是甲狀腺乳頭狀癌。而本研究結(jié)合臨床特征分析時發(fā)現(xiàn)CD4+PD-1在體質(zhì)指數(shù)異常的甲狀腺癌患者外周血中的表達低于甲狀腺癌體質(zhì)指數(shù)正常的患者，同時CD8+PD-1在BRAF基因突變的甲狀腺乳頭狀癌患者外周血中的表達也存在同樣的現(xiàn)象，這一結(jié)果尚需進一步擴大樣本量研究證實。在BRAF基因突變合并甲狀腺良性疾病(結(jié)節(jié)性甲狀腺腫或慢性淋巴細胞性甲狀腺炎)的甲狀腺乳頭狀癌患者外周血中，CD8+T細胞上TIGIT及Tim-3的表達明顯較未合并甲狀腺良性疾病的患者高，因此我們推測甲狀腺良性疾病可能是TIGIT及Tim-3表達上調(diào)的一個誘因，在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用，其機制尚需更多的研究確認。既往研究證實高齡是甲狀腺癌復發(fā)的危險因素[22]，Tim-3在腫瘤發(fā)生過程中優(yōu)先累積于CD8+T細胞導致其凋亡[23]，進一步影響免疫系統(tǒng)的有效應答。但本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌患者CD8+Tim-3的表達與年齡呈負相關(guān)，因此，我們推測對于年輕的甲狀腺癌術(shù)后患者外周血中Tim-3高表達可能是預后不良的危險因素，這有待于進一步隨訪患者預后進行相關(guān)性研究。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)后外周血T細胞PD-1和Tim-3、TIGIT表達與健康對照組存在差異，提示檢測外周血中上述指標的變化有助于評估甲狀腺癌患者術(shù)后免疫檢查點的狀態(tài)，開展深入研究可能為復發(fā)、轉(zhuǎn)移甲狀腺癌免疫治療，或聯(lián)合131碘同位素治療的開展，提供科學依據(jù)。