荔枝果皮中的美白劑根皮苷的提取、純化及鑒定

[摘要]目的：在荔枝果皮中提取和純化皮膚美白劑、抗氧化劑根皮苷，并進行結構鑒定。方法：新鮮荔枝果皮陰干，用70％乙醇溶液以超聲波浸提法提取，提取液經(jīng)過D101大孔樹脂吸附層析、C18小柱固相萃取、高效液相色譜法（HPLC）分離、純化后，采用質(zhì)譜法(MS)鑒定結構。結果：通過與根皮苷標準品對照，提取物的質(zhì)譜圖與根皮苷標準品的質(zhì)譜圖相符。結論：荔枝果皮中含有根皮苷，采用70%乙醇溶液超聲波浸提法可成功從荔枝果皮中提取到根皮苷。

[關鍵詞]荔枝果皮；根皮苷；提?。患兓?；鑒定

[中圖分類號]Q946.83[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）07-1032-03

Extraction， purification and identification of phloridzin from litchi peel

XIE Yang1，LAI Wei1，WAN Miao-jian1，XIE Xiao-yuan1，CHEN Li2

(1.Department of Dermatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， Guangdong China; 2.PG (China) Co.Ltd， Beijing 100000)

Abstract： ObjectiveTo extract phloridzin， a skin-whitening agent and antioxidant， from litchi peel， and identify the structure after purification.MethodsFresh litchi peel was air-dried， extracted with 70% ethanol solvent in ultrasonic wave. The extract was then purified with D101 macroporous resin adsorption chromatography， C18 solid phase extraction and high performance liquid chromatography (HPLC). And the component purified was identified by mass spectrography (MS).ResultsCompared with the phloridzin standard， the MS curves of the component coincided with those of phloridzin standard.ConclusionLitchi peel contains phloridzin， which can be extracted with 70% ethanol solvent diffusion in ultrasonic wave.

Key words: litchi peel；phloridzin；extraction；purification；identification

根皮素及其糖苷(見圖1)屬于黃酮類中的二氫查耳酮，是國內(nèi)外新近研究開發(fā)的一種新型皮膚美白劑和抗氧化劑。二氫查耳酮被稱為植物中的少數(shù)黃酮，在自然界分布較少，其中根皮素及根皮苷主要存在于蘋果、梨等植物的根莖和根皮中，因而得名，據(jù)文獻報道其多以糖苷的形式存在[1-2]。荔枝(Litchi chinensis Sonn)是中國嶺南地區(qū)盛產(chǎn)的特色水果，既往對荔枝果皮的研究發(fā)現(xiàn)，荔枝皮提取物有很強的抗氧化活性，并初步推斷其抗氧化成分中含有黃酮類物質(zhì)[3]。如能從荔枝果皮中提取和分離根皮苷，作為一種具有美白和抗衰老活性的天然原料應用于化妝品中，不僅來源廣泛，而且變廢為寶，可以帶來巨大的社會經(jīng)濟效益。目前尚沒有從荔枝中發(fā)現(xiàn)根皮苷的文獻報道，本文嘗試從荔枝果皮中提取根皮苷，并作純化和鑒定。

1實驗部分

1.1主要儀器、試劑和材料：Agilent 1100高效液相色譜儀（光電二極管陣列檢測器）、Ultimate C18柱（250mm×4.6mm，5μm），Dikma C18固相萃取小柱（500mg，3ml）。

API 4000 QTrap 液相色譜－三重四極桿/線性離子質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），數(shù)據(jù)自動關聯(lián)－增強子離子掃描，鎖定435.4 m/z，碰撞能量－15V、－30V、－45V三者疊加，掃描范圍50～500m/z。

KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器，功率100W。

HGC-12氮吹儀(天津恒奧公司)，溫度50 ℃。

D101大孔樹脂（天津南開和成公司）。

根皮苷標準品購自美國Sigma公司，純度≥99.0%。

流動相所用甲醇為色譜純（Dikma公司），實驗用水為去離子水。其余試劑均為分析純。荔枝品種為桂味，采自廣州增城船坑果園。

1.2 高效液相色譜條件：流動相A為甲醇，流動相B為0.1%乙酸（v:v，pH3.20），進樣量20μl，柱溫35 ℃，檢測波長286 nm。流動相梯度及流速見表1。

1.3 樣品處理：精密稱取根皮苷標準品0.0050g，溶于甲醇中，配制濃度0.002mg/ml和0.005mg/ml的標準品溶液，4℃避光保存。

新鮮荔枝果皮（連衣）陰干后，粉碎過40目篩。準確稱取荔枝皮粉末10.0g，加入70%乙醇150ml，超聲處理30min，功率100%。過濾后重復提取一次，合并濾液。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至70ml，加入180ml無水乙醇靜置，16h后以濾紙過濾。濾液減壓濃縮至醇全部揮發(fā)，加入純水150ml超聲輔助溶解，過濾后得到粗提液。

粗提液上樣至經(jīng)處理的大孔樹脂柱16g，上樣速度1 ml/min。然后以純水淋洗至無色（共450ml純水）。再以70%乙醇50ml解吸附，流速1ml/min，得到荔枝皮提取液，予4℃避光保存。

1.4 固相萃取：取荔枝皮提取液5ml以1ml/min流速通過活化后的固相萃取小柱（活化固相萃取小柱先用10ml甲醇通過小柱，再以10ml純水洗去甲醇，速度均為1ml/min），前3ml流出液棄去，余流出液收集。

1.5 純化：將固相萃取后流出液用氮吹儀濃縮至120μl，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后作高效液相色譜，收集相應保留時間流出的組分，得到純化后的單體化合物。

1.6 結構鑒定：將根皮苷標準品和荔枝果皮提取液經(jīng)純化后的單體化合物分別作高效液相色譜、質(zhì)譜檢測。其化學結構見圖1。

2結果

2.1 高效液相色譜結果：根皮苷標準品保留時間為21.444 min（圖2），荔枝果皮提取液在相同保留時間可見色譜峰（圖3），純化后的單體化合物保留時間與標準品基本一致（圖4）。

2.2 質(zhì)譜結果：根皮苷標準品主要質(zhì)譜峰（圖5）和荔枝果皮提取液純化后的單體化合物主要質(zhì)譜峰（圖6）一致。

3討論

根皮苷作為一種國際上日益重視的新型美白劑，其美白機制是它的水解產(chǎn)物根皮素能競爭性抑制皮膚黑色素細胞中的酪氨酸酶活性，從而干擾黑色素的合成，并且其抑制率優(yōu)于目前許多美白產(chǎn)品中使用的熊果苷和曲酸[4]。研究結果顯示，小鼠黑素瘤B16細胞和人上皮黑素細胞培養(yǎng)基中加入根皮素后，其酪氨酸酶活性、酪氨酸酶水平、酪氨酸酶相關蛋白-1、酪氨酸酶相關蛋白-2以及黑色素含量都較對照組低[5]。

根皮苷是水溶性的黃酮類物質(zhì)，極易溶于中濃度的醇溶液中，因此本實驗采用70%乙醇浸泡和超聲輔助法作初步的提取。但是粗提液中含有大量的雜質(zhì)，往往影響結果的判斷，必須進行凈化處理后才能有效判斷粗提液中是否含有根皮苷。

大孔樹脂是近十年來發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，它的吸附作用與表面吸附、表面電性或形成氫鍵等有關。由于具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用壽命長等優(yōu)點，大孔樹脂近年被廣泛用于天然物質(zhì)，尤其是多酚類物質(zhì)的分離。Dong[6]從多穗柯甜茶中提取根皮苷，以大孔樹脂初步分離，得到了較好的富集效果。本實驗中，經(jīng)過大孔樹脂吸附層析處理后，可以有效去除醇提液中大量的糖類、無機鹽、黏液等物質(zhì)，初步凈化和富集粗提液。

荔枝皮中除含有黃酮類物質(zhì)外，還含有油脂類物質(zhì)、蠟質(zhì)、色素等弱極性物質(zhì)，這些雜質(zhì)不僅影響黃酮類物質(zhì)的檢測，并在C18柱上殘留積累，降低柱效，因此樣品分析前需作脫脂處理。一般應用正己烷、石油醚等非極性有機溶劑進行脫脂，但是存在著操作復雜、還會在一定程度上造成黃酮類物質(zhì)損失的缺點，影響分析結果[7]。所以本實驗用固相萃取的方法代替，將黃酮類物質(zhì)和其他雜質(zhì)通過固相萃取小柱分離，從而簡便快速地達到凈化提取液的目的。

高效液相色譜（HPLC）是采用高壓下液體為流動相、高效能微粒為固定相以及高靈敏度檢測器的柱色譜技術。高效液相色譜能夠分析樣品，提供紫外波譜掃描，初步鑒定物質(zhì)的化學結構，并且對復雜的樣品具有強大的分離能力，具有靈敏度高、分析時間短的優(yōu)點。本實驗中根皮苷標準品的保留時間為21.444 min，經(jīng)過凈化的提取液在21.518 min處可見色譜峰，保留時間與標準品基本一致，因此初步判斷該色譜峰物質(zhì)為根皮苷，并可對其進行純化。

質(zhì)譜（MS）法是通過被測樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進行化合物結構分析的技術，它能夠提供可靠、精確的相對分子量信息和結構信息，具有高選擇性和高靈敏度，有研究顯示，其最低檢測限可低于1ng/ml[8]。本實驗中，純化后的單體化合物其主要的質(zhì)譜峰與根皮苷標準品基本一致，說明該單體化合物為根皮苷。

本文研究結果顯示，荔枝果皮中含有美白劑根皮苷，并且采用上述方法能成功分離、純化根皮苷，為以后的大批量生產(chǎn)以及對其生物學作用的進一步研究打下來基礎。

[參考文獻]

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[收稿日期]2008-04-15[修回日期]2008-07-08

編輯/張惠娟