Ｌ－精氨酸與纖維連接蛋白聯(lián)合應(yīng)用對創(chuàng)面愈合的影響

[摘要]目的：觀察L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）與纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）聯(lián)合應(yīng)用對傷口愈合過程的影響。 方法：建立大鼠背部創(chuàng)傷模型，在創(chuàng)面局部應(yīng)用纖維連結(jié)蛋白同時(shí)應(yīng)用L-精氨酸灌胃，分別在術(shù)后3、7、10、14天切取創(chuàng)面的愈合組織，進(jìn)行HE、VG染色和免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS12.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果：與對照組相比，聯(lián)合應(yīng)用FN和L-Arg組實(shí)驗(yàn)動物創(chuàng)面的愈合時(shí)間明顯比對照組和兩種藥物單獨(dú)應(yīng)用組縮短，差異有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論：L-Arg和FN聯(lián)合應(yīng)用對促進(jìn)大鼠背部創(chuàng)面的修復(fù)，縮短傷口的愈合時(shí)間具有顯著的效果。

[關(guān)鍵詞]創(chuàng)傷愈合；纖維連結(jié)蛋白；L-精氨酸；聯(lián)合應(yīng)用；免疫組織化學(xué)染色

[中圖分類號]R651.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）07-1028-04

The influence of L-Arginine mixed with fibronectin on the wound healing

QIU Shu-lin，CHU Guo-hua，ZHANG Pei-pei，ZHAO Wei，ZHU Hao，YAN Yan，HAN Sheng，F(xiàn)ENG Min，YAO Jin-ying

(Department of Plastic Surgery， Hebei People'S Hospital， Shijiazhuang 050051， Hebei，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effection of L-Arg mixed with FN on speed and quantity of the wound healing.MethodsBy making the wound model on the back of rats， each wound surface was injected with FN and lavaged with L-Arg. The tissue in the wound surface was taken respectively on the day of 3 days， 7 days， 10 days and 14 days. The sections of hematoxylin-eosin stain， collagen fibrils specific stain (Van Gieson，s) and immunohistochemistry were observed. All groups mean values were tested by SPSS12.0 in statistical management.ResultsCompared with the control group and the one medicine used alone ， using FN combined with L-Arg shorten the cure course obviously， and the result is significant（P<0.05）.ConclusionUsing FN externally combined with L-Arg promote the reparation course remarkably and shorten the cure course obviously.

Key words: wound healing; fibronectin; L-arginine; combination; immunohistochemistry

已有研究證實(shí)，纖維連結(jié)蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）對創(chuàng)傷愈合具有程度不同的促進(jìn)作用，但二者聯(lián)合應(yīng)用對創(chuàng)面愈合的影響目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察聯(lián)合應(yīng)用FN和L-Arg對創(chuàng)面愈合的影響，為臨床探索一條合理、科學(xué)、有效的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的新途徑。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組：健康雄性清潔級Wistar大鼠，共48只，平均體重（250±20）g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，隨機(jī)將動物分為4組，每組12只，即對照組（0.9%生理鹽水）、實(shí)驗(yàn)A組（聯(lián)合應(yīng)用FN+ L-arg）、實(shí)驗(yàn)B組（單獨(dú)應(yīng)用FN）、實(shí)驗(yàn)C組（單獨(dú)應(yīng)用L-arg）。

1.2 試劑：L－Arg（Sigma公司），F(xiàn)N（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所），羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔抗鼠一氧化氮合酶多克隆抗體（美國NeoMarKers公司），羊抗兔既用型SP法免疫組織化學(xué)染色試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法：大鼠背部剪毛，10%硫化鈉脫毛，溫水清洗，拭干。次日用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（30mg/kg），成功后，將大鼠固定在手術(shù)臺上。在背部脊柱兩側(cè)旁開1cm，頭尾兩端平行于脊柱各標(biāo)記一直徑1.8cm，面積2.54cm2的圓形切口線。經(jīng)碘伏消毒皮膚后，用剪刀沿標(biāo)記線剪除全層皮膚至深筋膜，形成4個(gè)圓形創(chuàng)面。A、B兩組每日每個(gè)創(chuàng)面筋膜層及創(chuàng)緣皮下組織內(nèi)注射0.5mg/ml的FN0.05ml（至標(biāo)本切取前一天止），A組同時(shí)將L-Arg按照500mg/kg/天予以灌胃，創(chuàng)面均用生理鹽水紗布包扎。實(shí)驗(yàn)C組以A組相同方法服用L-Arg，創(chuàng)面用生理鹽水紗布包扎。對照組只用生理鹽水紗布包扎傷口，各組動物均于手術(shù)后給予4萬單位慶大霉素肌注，每日一次，連續(xù)3天，預(yù)防感染。實(shí)驗(yàn)動物均單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.4 標(biāo)本取材及處理：分別于術(shù)后第3、7、10、14天切取以愈合創(chuàng)面中心為圓點(diǎn)直徑1.8 cm的圓形組織，4%多聚甲醛固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋切片，分別行常規(guī)HE染色、VG染色及免疫組化染色。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察

1.5.2 成纖維細(xì)胞數(shù)密度測定：400倍光鏡下觀察標(biāo)本HE染色切片，在組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取10個(gè)矩形視野（0.0052mm2/視野），目測計(jì)數(shù)并計(jì)算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果取均數(shù)。

1.5.3 膠原纖維面密度測定：400倍光鏡下觀察VG染色組織切片，在組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)計(jì)算紅染的膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。

1.5.4 NOS2（iNOS）免疫組化染色：對免疫組化染色切片，光鏡觀察一氧化氮合酶分布部位，著色深淺程度。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，選取每張切片中陽性細(xì)胞最集中區(qū)域，隨機(jī)取互不重疊的5個(gè)200倍視野，測陽性目標(biāo)面積占該視野的面密度，結(jié)果取均數(shù)。

1.5.5 創(chuàng)面愈合率的測定：采用計(jì)算機(jī)圖像處理儀(德國Zeiss 公司) 進(jìn)行測量和計(jì)算。傷后24 h第一次測量的創(chuàng)面面積為原始創(chuàng)面面積。計(jì)算方法：愈合面積=原始創(chuàng)面面積- 各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合面積百分比=(愈合面積/創(chuàng)傷面積)×100%。

1.5.6 創(chuàng)面愈合質(zhì)量的評價(jià)：通過測定創(chuàng)面肉芽組織羥脯氨酸含量來反映肉芽組織中膠原合成的情況，評價(jià)創(chuàng)面愈合的質(zhì)量。按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書操作，用比色法測定羥脯氨酸含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法：用 SPSS12.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察：與對照組比較，實(shí)驗(yàn)A組、B組、C組肉芽組織均較對照組肉芽組織生長好，炎癥反應(yīng)輕，愈合時(shí)間短，且新生皮膚組織張力較高。實(shí)驗(yàn)A組創(chuàng)面愈合質(zhì)量高于實(shí)驗(yàn)B組和C組。

2.2組織學(xué)觀察

2.2.1 光鏡觀察：與對照組比較，實(shí)驗(yàn)A組、B組、C組新生毛細(xì)血管生成較多，成纖維細(xì)胞增生活躍。創(chuàng)傷后第7～14天，實(shí)驗(yàn)A組較實(shí)驗(yàn)B組、C組成纖維細(xì)胞數(shù)量多，膠原纖維排列較整齊（圖1～3）。

2.2.2 成纖維細(xì)胞數(shù)密度：實(shí)驗(yàn)組A、B、C組在創(chuàng)傷后3、7天成纖維細(xì)胞數(shù)密度均高于對照組水平（P＜0.05），而在創(chuàng)傷后10、14天均低于對照組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)A組較B、C組更為明顯（P＜0.01）（見表1）。

2.2.3 膠原面密度：四組均呈持續(xù)性增加的趨勢，實(shí)驗(yàn)組A在所有時(shí)間點(diǎn)均高于對照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)B組、C組在所有時(shí)間點(diǎn)亦高于對照組（P＜0.05）（見表2，圖4～5）。

2.2.4 NOS2（iNOS）的測定：大鼠皮膚創(chuàng)傷后膠質(zhì)形成細(xì)胞、汗腺、毛囊和骨骼肌細(xì)胞以及創(chuàng)傷后肉芽組織的炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均不同程度的表達(dá)NOS2蛋白，免疫組化染色NOS2蛋白呈棕褐色或者棕黃色顆粒分布于上述組織細(xì)胞內(nèi)。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)A組、B組、C組在傷后第3天細(xì)胞陽性染色強(qiáng)度增強(qiáng)，以成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞為主，呈強(qiáng)陽性染色，新生表皮的陽性染色強(qiáng)度亦增強(qiáng)。3～7天細(xì)胞中的NOS2在細(xì)胞中的陽性表達(dá)相對維持穩(wěn)定水平，陽性細(xì)胞以毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞為主，均呈強(qiáng)陽性染色，并可見粗大強(qiáng)陽性顆粒密布于創(chuàng)緣角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿中，陽性比率較對照組增高（A組P＜0.01，B組、C組P＜0.05），傷后第10天肉芽組織中陽性細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞中的陽性表達(dá)達(dá)到高峰，其中A組的峰值明顯高于B、C兩組，但陽性比率較對照組小（P＜0.05），第14天陽性表達(dá)逐漸減弱，陽性比率較對照組高（A組P＜0.01，B、C組P＜0.05），角質(zhì)形成細(xì)胞仍為強(qiáng)陽性表達(dá)，但數(shù)量逐漸減少，其余細(xì)胞陽性染色程度減弱（見圖6，表3）。

2.2.5 創(chuàng)面愈合率：A、B、C三組于3天后創(chuàng)面愈合較對照組明顯加快，其中A組較B、C組顯著加快（A組P＜0.01，B、C組P＜0.05）。A組創(chuàng)面愈合良好，愈合時(shí)間較對照組提前3～4天，實(shí)驗(yàn)B組、 C組愈合情況良好，較對照組提前1～2天（見表4）。

2.2.6 羥脯氨酸含量：對照組羥脯氨酸含量從創(chuàng)傷后第3天到第14天進(jìn)行性增加；實(shí)驗(yàn)A組在創(chuàng)傷后各時(shí)間點(diǎn)羥脯氨酸含量均高于對照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)B組和C組在各時(shí)間點(diǎn)的的羥脯氨酸含量亦高于對照組（P＜0.05）（見表5）。

3討論

FN廣泛存在于機(jī)體組織中，具有參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘連、維持細(xì)胞正常形態(tài)、傷后作為基質(zhì)再生支架、調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動并促進(jìn)細(xì)胞遷移、參與止血和凝血以及調(diào)理、促進(jìn)細(xì)胞分化等生理作用。Arg可逆轉(zhuǎn)許多血管危險(xiǎn)因子引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，改善生殖、呼吸、腎功能、胃腸道、肝功能及免疫功能，有利于創(chuàng)面愈合[2]。藥理研究發(fā)現(xiàn)L -Arg的促愈合作用主要是通過NO來完成的。

本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用FN或L-Arg時(shí)，實(shí)驗(yàn)動物創(chuàng)面早期合成膠原和成纖維細(xì)胞的增殖較對照組加快（P＜0.05），但是聯(lián)合應(yīng)用組的膠原合成速度以及成纖維細(xì)胞的增殖速度則更加顯著，在7天后聯(lián)合應(yīng)用組創(chuàng)面收縮明顯加快，肉芽形成良好，成纖維細(xì)胞逐漸演變?yōu)槔w維細(xì)胞，膠原的排列也更加整齊（P＜0.01），使創(chuàng)面愈合時(shí)間較對照組提前3～4天，愈合后的創(chuàng)面質(zhì)量明顯優(yōu)于其余三組。其原因主要是對照組在創(chuàng)傷早期由于內(nèi)源性的FN和L-Arg濃度較低，而聯(lián)合應(yīng)用組通過外源性的FN和L-Arg補(bǔ)充使得血漿中FN濃度增加的同時(shí)，也增加了創(chuàng)面局部NO的濃度，致使A、B、C三組局部的NO濃度均高于對照組，使精氨酸酶有足夠的L-Arg底物分解成羥脯氨酸，進(jìn)一步形成膠原，表現(xiàn)出促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的趨勢，這種表現(xiàn)在聯(lián)合應(yīng)用組表達(dá)得更為顯著。Moor dean 等報(bào)道，F(xiàn)N在上皮細(xì)胞培養(yǎng)皿表面直接促進(jìn)上皮細(xì)胞粘附、擴(kuò)布和表皮細(xì)胞移行。FN是創(chuàng)面肉芽組織的重要基質(zhì)成分，可促使表皮細(xì)胞向創(chuàng)面中心呈定向移動。用不同動物間的皮膚做移植實(shí)驗(yàn)，顯示了FN 在重新上皮化中的作用[4]。

在實(shí)驗(yàn)中我們可以看到，大鼠皮膚創(chuàng)面在愈合過程中NOS2的表達(dá)呈現(xiàn)出先高后低然后再次升高的雙峰變化趨勢。在傷后前3天NOS2表達(dá)是增高的，從病理切片中可見創(chuàng)傷部位的單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等都有NOS2的表達(dá)，其中又以單核巨噬細(xì)胞的表達(dá)最為顯著[5]。創(chuàng)傷后3～7天對照組NOS2表達(dá)有所下降，這可能是Arg經(jīng)精氨酸酶水解后生成尿素和鳥氨酸，從而抑制了精氨酸酶通過增加NOS2合成NO。在創(chuàng)傷愈合后期，細(xì)胞內(nèi)的L-Arg被NOS2耗盡后，來自巨噬細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)的精氨酸酶表達(dá)上調(diào)且活性增強(qiáng)，與NOS2競爭細(xì)胞外有限的L-Arg，最終使合成的NO下降[6]。在傷后第10天NOS2表達(dá)出現(xiàn)第二次高峰，而在傷后14天開始下降，其原因可能是傷后第10天時(shí)創(chuàng)面周圍組織液中的IFN-γ、IL-2等各種正向細(xì)胞調(diào)節(jié)因子增多，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等表達(dá)NOS2，而到愈合晚期，由于炎癥反應(yīng)消退使NOS2的表達(dá)亦降低。而實(shí)驗(yàn)組的三組中，在傷后NOS2表達(dá)只在第7～10天出現(xiàn)一個(gè)峰值。在炎癥反應(yīng)最強(qiáng)烈的第7～10天，高于正常量的NO誘導(dǎo)高于正常量的細(xì)胞因子產(chǎn)生，其中包括正向調(diào)節(jié)NOS2生成的因子。在這些因子的誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞等可以大量表達(dá)NOS2[7]。隨著自身炎癥反應(yīng)的消退以及NO的反饋性抑制作用，在愈合晚期NOS2表達(dá)下降，這些也進(jìn)一步說明了損傷愈合晚期，低水平表達(dá)的NOS產(chǎn)生少量的NO，使精氨酸酶獲得足量的L-Arg底物，分解成羥脯氨酸并進(jìn)一步增加膠原的合成[8]，但精氨酸酶促進(jìn)膠原合成的過程是NOS依賴性的，這種低水平表達(dá)的NOS活性對膠原的合成是必不可少的[9]。這種表現(xiàn)以對照組最為明顯，也充分說明了由于外源性的FN和L-Arg的聯(lián)合應(yīng)用，能夠充分發(fā)揮二者的協(xié)同作用，加快了創(chuàng)面的炎性反應(yīng)，促進(jìn)了肉芽組織及表皮的生長，從而達(dá)到使創(chuàng)面早期愈合的目的。

創(chuàng)傷后創(chuàng)面愈合的時(shí)間和創(chuàng)面愈合面積的百分比是評估一種治療措施對創(chuàng)面愈合影響的一個(gè)綜合性指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究在大鼠創(chuàng)面愈合過程中人為的給予外源性的FN和L-Arg，其中實(shí)驗(yàn)組B、C較正常提前1～2天，而實(shí)驗(yàn)A組較對照組提前3～4天。這進(jìn)一步證明FN和L-Arg的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用，并顯示其聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)越性。

創(chuàng)傷修復(fù)是涉及整形外科及相關(guān)學(xué)科的重要課題，過程十分復(fù)雜，在以往的研究中，已證實(shí)FN和L-Arg具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生理功能，本實(shí)驗(yàn)研究將二者聯(lián)合應(yīng)用顯示其在促進(jìn)創(chuàng)面愈合中具有顯著的協(xié)同作用，但其確切的機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

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[收稿日期]2008-02-24[修回日期]2008-05-06

編輯/張惠娟