細(xì)胞懸液接種法血管瘤裸鼠動物模型的建立

[摘要]目的：探索人毛細(xì)血管瘤裸鼠移植瘤模型建立的條件。方法：將體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞通過注射的方式植入裸鼠(BALB/c nude mice)皮下，測量不同生長時期瘤體體積變化，觀察至60天后進(jìn)行病理學(xué)光鏡檢查，并通過血管內(nèi)皮細(xì)胞單克隆抗體CD31、細(xì)胞增殖標(biāo)記抗體Ki-67免疫組化染色研究所成瘤體的同源性及增殖活性。結(jié)果：通過皮下植入血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的方法成功建立了人血管瘤裸鼠動物模型，所成瘤體與原血管瘤生物學(xué)特點(diǎn)相似。結(jié)論：皮下植入人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的裸鼠動物模型建模方法可靠，能較真實(shí)地反映人血管瘤的發(fā)展過程，是研究血管瘤的較理想的平臺。

[關(guān)鍵詞]血管瘤；裸鼠；動物模型

[中圖分類號]Q813[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）07-1012-03

Establishment of the hemangioma model in nude mice by means of cell suspension inoculation

HU Xiao-yi1，YANG Zhuang-qun1，SONG Yong1，TU Jun-bo1，MA Jian-ming2，XU Quan3，LI Peng3

(1.Department of Oral and Maxillary Plastic Surgery，Stomatological Hospital， Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi，China；2.Department of Stomatology， the Affiliated Hospital of Qinghai University， Xining 810000， Qinghai， China；3.Department of Pediatric Surgery， the Second Hospital of Xi'an Jiaotong University， Xi'an 710004， Shaanxi， China)

Abstract:ObjectiveTo establish the human hemangioma model in nude mice.Methods Human hemangioma endothelial cells cultured in vitro were injected hypodermically into nude mice(BALB/c nude mice). The volume of in the transplanted tumor was measured in 60 days. Samples were taken from survival tumor and stained immunohistochemically by CD31 and Ki-67 before subjected to histopathological examination.ResultsHemangioma model were successfully established in nude mice and the original tumor histological characters were retained in the transplanted tumor.ConclusionHemangioma model established in nude mice by hypodermically injection with human hemangioma endothelial cells retains all the biological characteristics of the human hemangioma and can be a good model for research on hemangioma.

Key words: hemangioma;nude mice;disease model

血管瘤是嬰幼兒常見的良性腫瘤，在新生兒的發(fā)病率為1.1％～2.6％，1歲時的發(fā)病率高達(dá)10％。其中，35％～60％發(fā)生在頭頸部[1]。血管瘤的治療方法多樣，可通過激素、激光、手術(shù)等治療，但特殊類型和特殊部位的血管瘤則一直是臨床處理的難題。雖然血管瘤有自行消退現(xiàn)象，但也有部分不能消退者。由于對血管瘤生物學(xué)特性認(rèn)識不清，尚難以發(fā)現(xiàn)其規(guī)律，特別是血管瘤動物模型的缺乏，嚴(yán)重限制了對血管瘤的研究。因而建立一種相似性好的人血管瘤動物模型對于探求其生物學(xué)特性具有重大意義。本研究在體外成功培養(yǎng)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)上[2]，將其植入裸鼠皮下，生長成瘤建立裸鼠血管瘤動物模型，并探討其生物學(xué)特性。

1材料和方法

1.1 動物模型的建立：選擇BALB/c nu/nu裸小鼠16只，雌雄不限，鼠齡（32.2±3.2）天，體重（18.5±2.1）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供及飼養(yǎng)。將體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞濃集，達(dá)到約1×108個/ml，然后用注射器植入16只裸鼠腹部雙側(cè)皮下組織內(nèi)，每處約0.2ml，每只2處，共32處。植入完成后自然生長，每周定期觀察移植瘤生長情況。于移植后第7、30、45、60天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑 a 及橫徑 b，根據(jù)公式V=π/6×a×b2估算腫瘤體積變化，于第60天取每個標(biāo)本送病理檢查及檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原CD31、細(xì)胞增殖核抗原Ki-67。

1.2 CD31免疫組化檢測及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：將腫瘤組織蠟塊切片，同時取移植瘤所在裸鼠的皮下組織包埋、固定、切片。作鼠抗人CD31單克隆抗體標(biāo)記，抗體由西安華美生物技術(shù)有限公司提供。以裸鼠肌肉組織切片的CD31標(biāo)記為陰性對照，行移植瘤切片CD31免疫組化的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每個瘤組織CD31的陽性指數(shù)。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野，每個視野統(tǒng)計(jì)100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，其總數(shù)除以10，再乘100%，即為其陽性指數(shù)。

1.3 Ki-67免疫組化檢測及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：將腫瘤組織蠟塊切片，作Ki-67免疫組化檢測，同時以裸鼠肌肉組織切片的Ki-67標(biāo)記為陰性對照，同CD31法計(jì)算陽性指數(shù)。檢測結(jié)果用SPSS11.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 裸鼠及移植瘤的生長特點(diǎn)：飼養(yǎng)60天，所有裸鼠均健康存活，成瘤率為100％。所形成的瘤體顏色呈紫紅色，質(zhì)地中等偏軟。處死后切除瘤體送病理檢查前見瘤體與周圍組織界限清楚，并可見較多血管深入包膜內(nèi)。觀察期間腫瘤體積成逐漸增長趨勢，1個月內(nèi)增長速度相對緩慢，而1個月后增長速度明顯加快，大體生長情況見圖1，腫瘤體積增長數(shù)據(jù)見表1。

2.2 光鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察：鏡下可見典型的血管瘤組織表現(xiàn)：內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍，形成團(tuán)塊狀，偶見核分裂。可見毛細(xì)血管腔較密集，部分管腔被阻塞，呈裂隙狀(圖2)。

2.3 免疫組化檢測：CD31在存活移植瘤中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性指數(shù)42.33±3.10，作為對照的裸鼠肌肉組織內(nèi)為陰性。移植瘤中Ki-67表達(dá)的陽性指數(shù)為18.25±3.20，與裸鼠肌肉組織的Ki-67陽性指數(shù)1.85±0.46相比，具有顯著差異性(P＜0.01) (圖3、圖4)。

3討論

20世紀(jì)80年代以前，國內(nèi)外對脈管性疾病的分類、診斷比較混亂，統(tǒng)稱為血管瘤，以至于在治療上常常因“治療過渡”而帶來許多后遺癥或者因“治療不足”而貽誤時機(jī)。1982 年Mulliken 和Glowacki 根據(jù)脈管病變的臨床表現(xiàn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞的組織病理學(xué)特點(diǎn)及生物學(xué)特性，將其分為真性血管瘤(hemangioma)和脈管畸形( vascular malformations)，該分類系統(tǒng)有利于這類疾病的臨床診斷、治療，以及預(yù)后的評估，1996 年被國際脈管病變研究協(xié)會(ISSVA)所采納，本研究的目的在于建立真性血管瘤動物模型。

在血管瘤的研究中，有學(xué)者使用低等動物的血竇樣器官模仿血管瘤結(jié)構(gòu)，進(jìn)行治療方面的研究，如用雞冠建立毛細(xì)血管模型，研究激光的治療作用，用鼠脾作為海綿狀血管瘤的模型，研究硬化劑的治療作用。這些研究均不能真正地反映在活體內(nèi)血管瘤生長發(fā)育的真實(shí)情況和規(guī)律。近年來，制作血管瘤動物模型成為研究血管瘤的一種理想方法。國外學(xué)者已成功利用多瘤病毒轉(zhuǎn)錄或基因表達(dá)建立起鼠的血管瘤或血管內(nèi)皮瘤模型，甚至已形成特定的細(xì)胞系載瘤免疫缺陷鼠[3-9]，但其建立的血管瘤裸鼠表現(xiàn)出惡性內(nèi)皮細(xì)胞瘤特點(diǎn)，進(jìn)一步導(dǎo)致鼠的死亡。也有學(xué)者使用具有致瘤性的F-2鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞系建立動物模型，但其誘導(dǎo)的腫瘤模型，只能用于研究血管性腫瘤的生物學(xué)行為。目前已知的血管瘤動物模型的建立方法中，較為成功的是將血管瘤體以組織塊的方式植入裸小鼠皮下，逐漸生長形成瘤體，所形成的移植瘤與體內(nèi)正式血管瘤相似性較好[10]。

裸小鼠為免疫缺陷鼠，是建立腫瘤動物模型常用的動物。常用的建模方法主要有三種：藥物誘變法；細(xì)胞移植法；組織塊移植法。血管瘤是人體的良性腫瘤，目前尚未見利用藥物誘變方法成功建模的文獻(xiàn)報(bào)道。組織塊法建立模型時通常需要新鮮的無污染的標(biāo)本，要求瘤體在增殖期，且無硬化劑等其它治療史，往往不能及時獲得理想的標(biāo)本，特別是需要建立大量模型時。細(xì)胞移植的方法建模，則相對簡單易行。選擇合適標(biāo)本體外培養(yǎng)出血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，根據(jù)建模需要的量進(jìn)行傳代并濃集后行皮下植入。所培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞可凍存，在需要時復(fù)蘇后使用。

本研究采用體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，以注射皮下的方式植入裸鼠(BALB/c nude mice)，形成移植瘤，最終成功建立了相似性較好的血管瘤裸鼠動物模型。光鏡下移植瘤的組織形態(tài)表現(xiàn)同人體血管瘤細(xì)胞相似。血管瘤是由內(nèi)皮細(xì)胞克隆性增殖形成的良性腫瘤，有早期快速增殖和后期緩慢自然消退的特點(diǎn)。血管瘤內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞雖為腫瘤性，增殖期增殖活性較強(qiáng)，但分化較為成熟，成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物(Ⅷ因子相關(guān)抗原、CD31等[11-12])在血管瘤中大多數(shù)有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用鼠抗人CD31單克隆抗體檢測移植瘤組織，結(jié)果呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而作為對照的裸鼠肌肉組織則為陰性，表明其內(nèi)皮細(xì)胞來源于人而非裸鼠。血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖是血管瘤組織病理學(xué)的重要形態(tài)表現(xiàn)，它有別于血管畸形組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的成熟狀態(tài)，又能借以觀察血管瘤增生、退化進(jìn)程。Ki-67是一種貫穿表達(dá)于增殖期細(xì)胞的核抗原，可作為衡量細(xì)胞增殖狀態(tài)的客觀指標(biāo)。其表達(dá)增高，表明內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性高，內(nèi)皮細(xì)胞處于高增殖狀態(tài)，其表達(dá)降低，表明內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性低。本實(shí)驗(yàn)所測移植瘤Ki-67的表達(dá)明顯高于裸鼠肌肉組織，說明其有較強(qiáng)的增殖活性，符合增殖期血管瘤的特點(diǎn)。移植后及生長過程中未添加雌激素等其它干預(yù)因素。因此，所得到的移植瘤生物學(xué)特性同正常人體增殖期血管瘤生物學(xué)特性相似，該模型可成為動態(tài)研究血管瘤的較理想的平臺。

建立一種腫瘤動物模型的最終目的是為治療等進(jìn)一步研究做準(zhǔn)備。模型相似性好是一個必備條件，同時所建立的模型應(yīng)存在足夠的時間方能便于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)所建立的模型在60天時仍具血管瘤增殖期表現(xiàn)，其中在移植后第2個月內(nèi)增殖明顯，這便為藥物篩選及藥效觀察等進(jìn)一步研究提供了充足的時間，因而是一種較為理想的血管瘤研究動物模型。

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[收稿日期]2008-02-26[修回日期]2008-06-22

編輯/張惠娟