低溫快速成型個(gè)性化組織工程活性支架的制備及性能分析

[摘要]目的：以PLGA/TCP為原料應(yīng)用低溫冰型快速成型技術(shù)制備山羊顱骨缺損模型的個(gè)性化組織工程支架，復(fù)合rhBMP-2，分析其性能。方法：制造山羊顱骨缺損模型，三維CT重建，獲取NET運(yùn)行控制文件。將PLGA與TCP按7∶3的比例配成勻漿，加入低溫快速成型機(jī) 。在NET文件的指導(dǎo)下擠出三維PLGA/TCP支架，經(jīng)冷凍干燥，進(jìn)行凈化、消毒后，負(fù)壓抽吸復(fù)合rhBMP-2形成活性支架。對(duì)活性支架孔隙率測(cè)定、電鏡掃描、力學(xué)性能分析。結(jié)果：體溫快速成型制備的PLGA/TCP支架材料圓形略有弧度，與顱骨缺損模型的形態(tài)非常吻合。支架結(jié)構(gòu)的孔隙率為89.6%。掃描電鏡觀察材料密布大孔及微孔結(jié)構(gòu)，大孔平均360μm，微孔為3～5μm，孔間相互貫通。復(fù)合rhBMP-2的PLGA/TCP支架在大孔及微孔中都吸附著大量微粒。支架材料的抗壓強(qiáng)度0.68MPa ，彈性模量17.87MPa。結(jié)論：低溫快速成型制造的PLGA/TCP個(gè)性化支架屬仿生設(shè)計(jì)，孔隙率符合人工骨支架的生理要求，生物力學(xué)強(qiáng)度略低于人松質(zhì)骨，但強(qiáng)度不影響植入手術(shù)。負(fù)壓抽吸法促進(jìn)rhBMP-2與支架的充分復(fù)合制備成活性支架。

[關(guān)鍵詞]快速成型；組織工程支架；PLGA/TCP

[中圖分類號(hào)]Q813[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）07-1008-05

Manufacture and property analysis of individual active tissue engineering scaffolds by low-temperature rapid prototyping technology

LEI Hua，YU Dong，TANG Xiao-jun，ZHANG Zhi-yong，YU Bing，NIU Feng，GUI Lai

（Center of Cranio-Maxillofacial Surgery，the Sixth Department，Plastic Surgery Hospital， Peking Union Medical College， China Academy of Medical Sciences， Beijing 100144， China）

Abstract：ObjectiveTo manufacture individual PLGA/TCP porous scaffolds bylow-temperature deposition rapid prototyping technology according to the model of calvarial critical defect in a goat cranial bone and to load the PLGA/TCP scaffolds with rhBMP-2. To analyze the scaffolds' natures.MethodsTo make a critical defect in goat cranial bone and get NET files from CT scan data of critical defect. To infuse the mixture of PLGA and TCP (7:3) into low-temperature rapid prototyping machine and the machine guided by NET files manufactured individual PLGA/TCP porous scaffolds which then were cryodesiccated， cleaned， sterilized and loaded with rhBMP-2 to conform active scaffolds. The factor of porosity of the scaffold was measured. The micro structure of the scaffold was observed with electron microscope and the mechanics property of the scaffold was analyzed. ResultsThe shape of individual PLGA/TCP porous scaffolds manufactured by low-temperature deposition rapid prototyping technology is very similar to the model of goat calvarial critical defect. The factor of porosity of the scaffold is 89.6%. The PLGA/TCP scaffoldshas controlled microstructure and porosity with 360μm diameter mini-holes， 3-5μm diameter micro-holes. These holes are connected with each other. RhBMP-2 particles are evenly loaded in all mini and micro holes. The crushing strength of the scaffold is 0.68MPa and the elastic modulus of the scaffolds is 17.87MPa.ConclutionThe design of low-temperature deposition rapid prototyping technology is bionic design. The individual scaffolds have appropriate factor of porosity. Although the vitodynamics strength of the scaffolds is less than human cancellous bones， it still meets the requires of implant operation. Negative pressure suction can facilitate rhBMP-2 evenly dispersed in scaffolds to conform active scaffolds.

Key words：rapid prototyping；tissue engineering scaffold；PLGA/TCP

顱頜面骨多為不規(guī)則骨，具有精細(xì)的三維立體結(jié)構(gòu)，其本身形態(tài)特性及損傷原因的多樣性與不確定性決定了缺損形態(tài)的復(fù)雜性。因此，顱頜面骨缺損的修復(fù)體個(gè)性化修復(fù)尤為重要。本研究應(yīng)用低溫?cái)D出快速成形工藝，制造PLGA/TCP三維個(gè)性化支架，在支架材料上復(fù)合rhBMP-2，使之成為新型顱頜面骨組織工程的活性支架材料，并對(duì)支架的各項(xiàng)性能進(jìn)行分析。

1材料和方法

1.1 制備山羊的顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型[1]：選取雄性中國(guó)青山羊(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)整形外科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，顱頂正中切口顯露顱頂骨，在中央造成直徑為2.2mm骨與骨膜圓形缺損。術(shù)后即刻行顱骨CT掃描，三維重建。

1.2 PLGA/TCP復(fù)合人工骨支架材料的快速成型制造

1.2.1 制備支架材料勻漿：PLGA（中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所）固體研磨粉碎，加1， 4一二氧六環(huán)溶液（西安化學(xué)試劑廠）充分溶解。加入TCP(鈣磷比為1.5:1)粉末（上海試劑四廠)，充分混合，PLGA:TCP=7:3。

1.2.2山羊標(biāo)準(zhǔn)顱骨缺損修復(fù)體支架材料的成形過程：清華大學(xué)激光快速成型中心開發(fā)研制的低溫?cái)D出成形設(shè)備-快速成型機(jī)TissFormTM 的基本原理：將復(fù)雜的三維實(shí)體的成形離散為一系列二維層片的逐層成形和堆積過程[2-3]。快速成型機(jī)的主要部件由儲(chǔ)料罐、噴頭和位于低溫成形室內(nèi)的工作臺(tái)組成（圖1）。

山羊顱骨缺損三維CT重建圖像重構(gòu)處理，得到缺損區(qū)電子模型（圖2）。對(duì)缺損模型行數(shù)據(jù)處理，獲得控制噴頭掃描的NET文件。如圖3所示將制備的PLGA/TCP勻漿加入儲(chǔ)料罐中，在NET文件的控制下，噴嘴先沿X軸方向進(jìn)行N層掃描，噴嘴的直徑為0.3mm，工作臺(tái)下移0.15mm (h值)，噴嘴改為沿Y軸方向進(jìn)行N層掃描，漿料垂直落于上一層材料上，將其稍作溶解融合之后凍成固態(tài)，依此步驟，噴嘴分別沿X軸方向和Y軸方向交替往復(fù)進(jìn)行掃描填充，完成Z層后制造結(jié)束，N是由支架材料的每軸掃描層數(shù)數(shù)據(jù)所規(guī)定的，例如圖4中所成形的材料的N=3 。通過調(diào)整細(xì)絲間的距離((d值)控制網(wǎng)格的大小，決定了孔隙在水平和豎直截面內(nèi)的尺寸大小，細(xì)絲的長(zhǎng)度決定支架材料的外形，參數(shù)Z和N決定支架材料的厚度。

將冷凍狀態(tài)的PLGA/TCP支架材料置于Alphal-2型冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Martin Christ公司生產(chǎn))500Pa負(fù)壓下冷凍干燥38h，有機(jī)溶劑在真空環(huán)境中升華，在材料的細(xì)絲上形成微小的孔隙，而大的孔隙是成形過程中規(guī)定的。到此，多孔的PLGA/TCP山羊標(biāo)準(zhǔn)顱骨缺損修復(fù)體支架材料制備完成，如圖5所示，為圓形略有弧度的山羊顱骨人工骨支架材料，成形參數(shù)：d值=0.8mm ，N=30。

1.3 復(fù)合rhBMP-2制備活性組織工程支架：支架材料殘留微量機(jī)溶劑，會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到毒害作用。因此使用前支架材料置入醫(yī)用95%的酒精中浸泡24h，去離子水清洗浸泡48h。低溫烘干，塑料袋密封，環(huán)氧乙烷消毒[4]。將凈化消毒的PLGA/TCP支架材料浸泡于75%酒精中30min，去離子水中30min，再用去離子水中漂洗3次，離心排除大部分水份。在濕化的支架材料上均勻取三點(diǎn)作為復(fù)合點(diǎn)，每點(diǎn)滴加8μl NaH2PO4，隨即滴加66.7μl rhBMP-2溶液，每個(gè)支架共復(fù)合lmg rhBMP-2。將支架材料置入無菌試管，軟塞密封，注射器反復(fù)抽吸，促進(jìn)rhBMP-2向材料內(nèi)部滲透吸附。在凍干機(jī)內(nèi)凍干，密封，4℃冷藏備用（圖6）。

1.4 孔隙率的測(cè)定：采用排液法測(cè)定材料的孔隙率。選擇乙醇為液體用于PLGA/TCP支架材料孔隙率的測(cè)定。

1.5 掃描電鏡觀察：分別取PLGA/TCP支架材料的徑向面和橫斷面，抽氣處理后，直接在電鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 力學(xué)性能分析：采用美國(guó)Rheometric Scientific公司生產(chǎn)的Minimat 2000型微型材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)定支架的壓縮力學(xué)性能。采用1000N載荷量，加載速度為1 mm/min，選擇的外觀尺寸為6.5mm×6.5mm×13.5mm，共測(cè)試6個(gè)樣品。PLGA/TCP人工骨支架的測(cè)量值壓縮彈性模量(17.87±2.0l)MPa和抗壓強(qiáng)度(0.68±0.08)MPa測(cè)得的數(shù)據(jù)與成年人股骨和腰椎的力學(xué)性能進(jìn)行的比較 (表1) 。

2結(jié)果

2.1 大體觀察：快速成型制備的PLGA/TCP人工骨支架材料圓形略有弧度，與顱骨缺損的形態(tài)非常吻合。肉眼可見材料密布徑向分布大的孔隙，呈網(wǎng)格狀（圖5）。

2.2 孔隙率的測(cè)定：選擇乙醇為液體用于支架材料孔隙率的測(cè)定，乙醇能夠充分地浸潤(rùn)PLGA/TCP，而且不會(huì)改變PLGA/TCP支架材料物理及化學(xué)性狀，測(cè)得多孔支架結(jié)構(gòu)的孔隙率為89.6%。

2.3 支架材料的掃描電鏡觀察：材料徑向面、橫斷面密布類圓形和橢圓形的大孔結(jié)構(gòu)，大孔呈徑向分布，平均大小約為360μm，相互貫通，孔徑較為光滑，沒有尖銳的突起，孔壁的平均寬度300μm。在大孔的周圍、內(nèi)部以及材料絲上布滿了的微孔結(jié)構(gòu)，微孔也是相互貫通，外型多為近似圓形，孔徑大小約為3～5μm (圖7) 。

復(fù)合rhBMP-2的PLGA/TCP復(fù)合人工骨在大孔周圍的材料細(xì)絲中存在大量的微孔結(jié)構(gòu)，在大孔及微孔中都吸附著大量的相應(yīng)大小的rhBMP-2微粒，分布較為均勻。從材料斷面的掃描電鏡照片可以看到在材料的內(nèi)部的微孔上也同樣吸附著rhBMP-2微粒 (圖7) 。

2.4力學(xué)性能分析：見表1。

3討論

3.1支架材料制造工藝分析：目前有多種骨組織支架成形方法。傳統(tǒng)方法有固液相分離法[5-6]、氣體發(fā)泡和溶鹽法[7]等。這些工藝適合制備孔隙直徑為200μm以下的可控孔隙結(jié)構(gòu)，但很難制備直徑為200～500μm之間的可控孔隙結(jié)構(gòu)。基于快速成形原理的骨組織支架成形方法，主要有立體光固化工藝[8]、熔融沉積工藝[9-10]和三維打印工藝[11]。這些快速成形方法可以很好地加工出數(shù)百微米的孔隙結(jié)構(gòu)，但難以成形更小的孔隙。

本研究采用一種制造PLGA/TCP復(fù)合人工骨支架材料的新型快速成型工藝[12-13]，即低溫?cái)D出快速成形工藝，在可控孔隙結(jié)構(gòu)和用戶化植入物的制造方面有傳統(tǒng)支架材料成形工藝等不可比擬的優(yōu)勢(shì)。制造的支架材料孔隙率和孔隙大小是可以在制造時(shí)進(jìn)行預(yù)先規(guī)定的，通過控制每條原料細(xì)絲的間距，可控制大孔結(jié)構(gòu)的大小與走形方向；控制噴嘴的大小來改變?cè)霞?xì)絲的粗細(xì)，可控制材料的孔隙率和材料的力學(xué)強(qiáng)度，并可影響小孔結(jié)構(gòu)的大小。其制備的材料，具有平均大小約為360μm的大孔結(jié)構(gòu)。在大孔的周圍布滿了相互貫通的微孔結(jié)構(gòu)，外形多為近似圓形，微孔徑大小約為3～5μm，孔隙間相互貫通，孔隙率89.6%，其立體結(jié)構(gòu)符合骨組織工程的要求。在臨床中同樣依此步驟，將制造出個(gè)性化具有三維復(fù)雜內(nèi)結(jié)構(gòu)的修復(fù)體。

另外，立體光固化工藝[8]、熔融沉積工藝[9-10]和三維打印工藝[11]的成形過程由于存在熱相變等過程，對(duì)生物材料的性能尤其是生物活性有不可避免的影響。低溫?cái)D出快速成形工藝采用非加熱的方式液化原料，并在低于0℃的環(huán)境中堆積成形，在成形過程中可以很好的保持材料的生物學(xué)性能。即使是對(duì)溫度非常敏感的一些生物活性蛋白，經(jīng)過這樣的處理過程，其生物活性也不會(huì)受到影響。所以使在成形過程中直接加入生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)成為可能。

除了成形的多孔支架材料在力學(xué)上和人皮質(zhì)骨有較大差距這一缺點(diǎn)外，低溫成形不是即刻的，制造工藝需要一定的時(shí)間，精細(xì)度仍需要進(jìn)一步調(diào)整。rhBMP-2的復(fù)合還不能在成形過程中進(jìn)行。

3.2 材料的選擇：本實(shí)驗(yàn)選擇TCP和PLGA搭配，基于如下考慮：①將TCP引入PLGA使TCP顆粒鑲嵌于PLGA中，改善材料親水性，提高PLGA與細(xì)胞的親和性；②TCP鈣/磷比為1.5:1，接近正常骨組織，并且其降解性優(yōu)于其他生物陶瓷，同時(shí)TCP具有良好的骨傳導(dǎo)性能和生物相容性[14]；③PLGA降解后在局部積聚的酸性代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用。TCP降解后呈弱堿性，可中和PLGA的酸性降解產(chǎn)物，弱化對(duì)細(xì)胞的毒性作用，增加材料的細(xì)胞相容性；④TCP和PLGA各自在動(dòng)物體內(nèi)完全降解的時(shí)限與骨折自然愈合時(shí)間相接近，有利于成骨與降解速率的匹配；⑤TCP的降解過程中，局部Ca2+和PO44-濃度增加，在TCP植入體的表面形成一個(gè)碳酸磷灰石結(jié)晶層，從而刺激骨組織的再生[15]。

3.3 組織工程技術(shù)的應(yīng)用：構(gòu)建組織工程骨的方式有幾種：①支架材料與成骨細(xì)胞；②支架材料與生長(zhǎng)因子；③支架材料與成骨細(xì)胞加生長(zhǎng)因子。本研究采用rhBMP-2復(fù)合PLGA/TCP復(fù)合支架材料，BMP有誘導(dǎo)成骨作用，可誘導(dǎo)血管周圍的間充質(zhì)細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。在復(fù)合點(diǎn)滴加NaH2PO4堿化材料，目的是中和PLGA/TCP酸性代謝物，減輕對(duì)細(xì)胞的毒害。負(fù)壓抽吸的目的是促進(jìn)rhBMP-2與材料的充分結(jié)合，從復(fù)合后的電鏡的斷面像可以看到，rhBMP-2與支架材料的復(fù)合十分充分。

3.4 材料的孔隙率與力學(xué)的要求：研究表明孔徑150～500μm是最適合細(xì)胞的黏附及生長(zhǎng)?？紫堵室灿幸欢ǖ囊?，理想的要達(dá)到90%以上，孔隙率低生物學(xué)特性較差且降解較慢，孔隙率高生物學(xué)特性好但降解加快，理想的孔隙的互通率是100%[16]。本試驗(yàn)PLGA/TCP復(fù)合人工骨支架材料孔隙的大小、孔隙率、孔隙互通率與人松質(zhì)骨相似，但力學(xué)強(qiáng)度低于松質(zhì)骨。從理論而言，人工骨支架應(yīng)該與正常人骨的力學(xué)性能相匹配，但實(shí)際研究中，人工骨支架必須具有多孔疏松結(jié)構(gòu)，孔隙率要非常高，在現(xiàn)有技術(shù)條件下，很難兼顧這兩方面的性能，但這并不影響其在臨床的應(yīng)用。首先，可以依靠堅(jiān)強(qiáng)內(nèi)固定來彌補(bǔ)這個(gè)不足之處，其次，針對(duì)整形外科領(lǐng)域而言，多為顱頜面非承重骨質(zhì)缺損的修補(bǔ)，或者作為骨量不足時(shí)的填充貼敷植骨，主要用于修復(fù)外形輪廓，很少會(huì)涉及到承重骨的修復(fù)問題，因而對(duì)修復(fù)體的力學(xué)要求就更低一些。

低溫快速成型技術(shù)可以很好地保持材料的生物學(xué)性能，并可控制大小孔的形態(tài)、分布及走向，大孔直徑約為360μm，小孔直徑3～5μm，外形圓潤(rùn)，并相互貫通，有很高的孔隙率，達(dá)89.6%，符合人工骨支架的生理要求。生物力學(xué)強(qiáng)度低于人松質(zhì)骨，但不影響手術(shù)植入。運(yùn)用組織工程原理，采用三點(diǎn)法均勻滴加rhBMP-2，負(fù)壓抽吸促進(jìn)rhBMP-2與支架的充分復(fù)合。

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[收稿日期]2008-03-28[修回日期]2008-06-19

編輯/張惠娟