綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

編者按：2008年諾貝爾自然科學(xué)獎(jiǎng)?lì)C布后，相關(guān)的介紹與報(bào)道鋪天蓋地。其中一條新聞很有意思，在諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主下村修的出生地日本，養(yǎng)殖在一家水族館里的一種多管水母也一夜成名，吸引了無數(shù)人前來參觀，因?yàn)橄麓逍拚菑倪@種水母身上發(fā)現(xiàn)了后來讓他獲獎(jiǎng)的綠色熒光蛋白。其實(shí)下村修本人的經(jīng)歷，也如同這種水母一樣：作為綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者，、幾十年來一直默默無聞，甚至他本人當(dāng)初都沒有預(yù)見到該項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的價(jià)值。如果不是后來幾位有技術(shù)、工程背景的研究人員在基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用之間架起橋梁，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)恐怕還淹沒在論文堆中。與PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)一樣，又一項(xiàng)與生物和生命科學(xué)有重要相關(guān)的技術(shù)獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，這給化學(xué)家們，尤其是從事基礎(chǔ)研究的化學(xué)家們帶來哪些啟示呢?我刊約請中科院理化技術(shù)研究所吳世康研究員介紹綠色熒光蛋白及其發(fā)現(xiàn)過程。

2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了從事有關(guān)“綠色熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，表達(dá)和發(fā)展”并取得重要成就的三位科學(xué)家：下村修、馬丁·查爾菲和錢永健。

綠色熒光蛋白及其發(fā)光機(jī)理

綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP)是一種在美國西北海岸所盛產(chǎn)的水母中所發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)。這類學(xué)名為Aequorea victoria的水母有著美麗的外表，生存歷史超過1.6億年。1962年，下村修正是在這種水母的發(fā)光器官內(nèi)發(fā)現(xiàn)天然綠色熒光蛋白。它之所以能夠發(fā)光，是因在其包含238個(gè)氨基酸的序列中，第65至67個(gè)氨基酸(絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸)殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時(shí)，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導(dǎo)致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應(yīng)。但此時(shí)還不能發(fā)射熒光，只有當(dāng)有分子氧存在的條件下，發(fā)生氧化脫氫，方能導(dǎo)致綠色熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的“成熟”，形成可發(fā)射熒光的形式。上述綠色熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的形成過程，系由幾位科學(xué)家分別研究完成的。

綠色熒光蛋白不僅無毒，而且不需要借助其他輔酶，自身就能發(fā)光，可以讓科學(xué)家在分子水平上研究活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程。當(dāng)綠色熒光蛋白的基因和我們感興趣的有機(jī)體內(nèi)所擬研究的蛋白質(zhì)基因相融合時(shí)，蛋白質(zhì)既能保持其原有的活性，綠色熒光蛋白的發(fā)光能力也不受影響。通過顯微鏡觀察這種發(fā)光的“標(biāo)簽”，科學(xué)家就能做到對蛋白質(zhì)的位置、運(yùn)動(dòng)、活性以及相互作用等一目了然。在一個(gè)活體中有數(shù)萬種不同的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)精細(xì)地控制著重要的化學(xué)進(jìn)程。如果蛋白機(jī)制發(fā)生故障，通常就會(huì)t發(fā)生疾病。綠色熒光蛋白可幫助研究這類機(jī)制，這就是為什么綠色熒光蛋白成為生物科學(xué)極其重要的工具。在它的幫助下，科學(xué)家還能對各種細(xì)胞的命運(yùn)了如指掌，比如，腦神經(jīng)細(xì)胞是如何發(fā)育起來的，或者癌癥細(xì)胞是如何擴(kuò)散的……

今天，已經(jīng)有了許多新的不同的綠色熒光蛋白變體，這就進(jìn)一步完善了綠色熒光蛋白作為基因標(biāo)志在生物研究中的廣泛應(yīng)用。

下村修與綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)

Aequorea victoria水母是一種生物發(fā)光體。1960年，下村修為搞清它的生物發(fā)光機(jī)制，參加了普林斯頓大學(xué)弗蘭克·約翰遜實(shí)驗(yàn)室的工作。Aequorea victoria生物發(fā)光的活性組分曾被認(rèn)為是一種與鈣離子相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，被稱為水母素(水母素現(xiàn)在仍是一種檢測生物體內(nèi)鈣離子的方法之一)。但在此形式下，所發(fā)射的是藍(lán)光。對此，下村修曾做了大量的工作來說明所發(fā)射的熒光究竟是綠光還是藍(lán)光。研究人員分離了大量的蛋白質(zhì)，都顯示出強(qiáng)烈的綠光，于是他在1962年寫道：“由蛋白質(zhì)所得的溶液在日光下是稍稍發(fā)綠的，但在鎢燈下則為黃色，在紫外光下則呈現(xiàn)出很亮的、綠色的熒光”。應(yīng)當(dāng)說，對這一問題的認(rèn)識是在不斷提高的。他們在無直接試驗(yàn)證據(jù)的情況下，提出了綠色熒光蛋白所發(fā)的綠光是因受鈣激發(fā)而發(fā)光的水母素，其能量向綠色熒光蛋白發(fā)生了轉(zhuǎn)移所致。按現(xiàn)代的科學(xué)術(shù)語來說，水母素是作為一種能量給體，而綠色熒光蛋白則成為能量受體。這一觀點(diǎn)，后來得到了實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。但應(yīng)當(dāng)指出的是兩種色素是獨(dú)立存在的，并無依賴關(guān)系。

雖然綠色熒光蛋白最初只是水母素研究中的一項(xiàng)偶然發(fā)現(xiàn)的“副產(chǎn)品”，但總的說來，下村修在發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的過程中作出了重要的貢獻(xiàn)。如對其純化和物理化學(xué)表征等方面，以及在不同條件下的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的測定等，綠色熒光蛋白與水母素兩者間的能量轉(zhuǎn)移，并解釋了由綠色熒光蛋白發(fā)射的是綠光而不是藍(lán)光。如果沒有這些經(jīng)典性開創(chuàng)工作，有關(guān)綠色熒光蛋白的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用將推遲幾十年，甚至至今它仍作為一種秘密保留在太平洋中。

查爾菲把綠色熒光蛋白用于有機(jī)體

1985年，道格拉斯·普瑞舍克隆了水母素的基因。1992年，他又克隆出完整的由238個(gè)氨基酸編碼的綠色熒光蛋白基因?？上У氖?，普瑞舍沒有進(jìn)一步嘗試把該基因引入其他生物體內(nèi)，雖然他在1992年的有關(guān)克隆工作的總結(jié)中最后指出：“迄今尚無可用的發(fā)色團(tuán)生物合成的有關(guān)信息，而這種蛋白質(zhì)的重組方式可以成為一種有價(jià)值的試劑，使我們可在這類特殊的蛋白質(zhì)內(nèi)，來試驗(yàn)發(fā)色團(tuán)生成的生物化學(xué)，以及在水母素和綠色熒光蛋白間的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制等”。將綠色熒光蛋白表達(dá)到其他有選擇的有機(jī)體這項(xiàng)工作，具有重大的生物學(xué)意義。這就涉及馬丁·查爾菲的工作了。

馬丁·查爾菲所從事的研究是有關(guān)小線蟲神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)展。當(dāng)查爾菲第一次聽說到綠色熒光蛋白時(shí)，他十分激動(dòng)地從利用分子遺傳學(xué)方法來研究線蟲問題，轉(zhuǎn)移到將綠色熒光蛋白與有機(jī)體中蛋白質(zhì)基因相融合的工作，并先后在兩種小線蟲中得到表達(dá)，即綠色熒光蛋白在不同的有機(jī)體中顯示出亮綠色的熒光，因此確認(rèn)了綠色熒光蛋白可作為一種通用的基因標(biāo)志，而應(yīng)用于各種有機(jī)體中。接著，他還得到了綠色熒光蛋白在有機(jī)體內(nèi)的不同部位和不同時(shí)間發(fā)展下的表達(dá)結(jié)果。1994年2月初查爾菲及其合作者把這些研究結(jié)果發(fā)表在《科學(xué)》雜志上，并引起轟動(dòng)。

綠色熒光蛋白的熒光形式不僅可用以表達(dá)小線蟲、果蠅等，對哺乳動(dòng)物的細(xì)胞也適用，從而使定量研究活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程成為可能。查爾菲等人的工作向人們展示出，綠色熒光蛋白作為一種通用的基因標(biāo)志，在生物研究中有著無限的潛力。

錢永健的貢獻(xiàn)

錢永健和他的同事不僅加深了對綠色熒光蛋白發(fā)光機(jī)制的了解，比如分子氧的作用，由此可以解釋為什么綠色熒光蛋白在有機(jī)體內(nèi)可容易地發(fā)射熒光。更重要的是發(fā)現(xiàn)了一些新的具有不同光譜行為的綠色熒光蛋白變體，從紫外部分一直位移到藍(lán)色。這些結(jié)果表明，綠色熒光蛋白在進(jìn)行取代或進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)換上是十分活潑的，而這些改進(jìn)了的綠色熒光蛋白，為其在生物科學(xué)中的成功應(yīng)用鋪設(shè)了一條康莊大道。

錢永健及其合作者，還解決了綠色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)問題，從而允許能夠較合理地對具不同性質(zhì)的變體合成進(jìn)行設(shè)計(jì)。這些新變體有的熒光更強(qiáng)，有的呈黃色，有的呈藍(lán)色，有的呈紅色，有的可激活、可變色。這意味著除綠色以外，還可以用其他顏色熒光蛋白標(biāo)示不同的蛋白質(zhì)和細(xì)胞。今天，綠色熒光蛋白及其變體作為基因標(biāo)志，已實(shí)現(xiàn)了工具化，有了通用的“工具盒”，可應(yīng)用于所有生命體系中的科學(xué)研究。

在此筆者還想談一點(diǎn)感想。雖然這一獲獎(jiǎng)項(xiàng)目為化學(xué)獎(jiǎng)，但是它所涉及的大量工作都和生物和生命科學(xué)相關(guān)，包括所研究對象，以及它的實(shí)際應(yīng)用等。這說明現(xiàn)代科學(xué)的分類已不拘泥于以往的格局。這還使我聯(lián)想到目前我們化學(xué)家對于物理和生物科學(xué)的生疏，以及物理學(xué)家見到苯環(huán)結(jié)構(gòu)而害怕的情況。這些現(xiàn)狀表明，我們的大學(xué)教育確是有進(jìn)一步改革的必要。

[責(zé)任編輯]龐云