高住低訓(xùn)抑制大鼠骨骼?。恚裕希业鞍妆磉_

賀道遠　曾凡星　王偉明

摘 要：目的：探討運動和低氧影響骨骼肌生長的分子調(diào)控機制。方法：SD大鼠分為6組：1) 28 d組，包括對照組、常氧運動組、低氧暴露組、高住低訓(xùn)組；2) 復(fù)氧7 d組，包括低氧暴露復(fù)氧7 d組、高住低訓(xùn)復(fù)氧7 d組，每組6只。常氧運動組進行4周的跑臺運動。低氧暴露組白天與對照組在常氧下生活，晚上在氧濃度13.6%低氧艙內(nèi)低氧暴露12 h；復(fù)氧7 d組進行低氧暴露后復(fù)氧7 d。高住低訓(xùn)組每天運動后1 h進行低氧暴露。實驗后取腓腸肌稱重，采用western blot測定mTOR蛋白表達。結(jié)果：1) 28 d常氧運動后骨骼肌mTOR蛋白表達明顯上降（p<0.05）；2) 28 d高住低訓(xùn)后骨骼肌mTOR蛋白表達明顯下降（p<0.05），復(fù)氧7 d后顯著回升（p<0.05）。結(jié)論：運動和低氧調(diào)節(jié)骨骼肌mTOR蛋白表達，提示高住低訓(xùn)抑制骨骼肌生長可能與運動、低氧調(diào)控骨骼肌mTOR信號并影響蛋白翻譯過程有關(guān)。

關(guān)鍵詞：低氧；高住低訓(xùn)；翻譯調(diào)控；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）

中圖分類號：G804.2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-3612(2008)08-1073-03

On the Living-High-Training-Low Restraining mTOR Protein Expression of Skeletal Muscle in Rats

HE Dao-yuan1, ZENG Fan-xing2, WANG Wei-ming1

(1.College of Physical Education, Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei China; 2.Beijing Sports University,Beijing 100084,China)

Abstract:Objective: to research the effect of exercise and hypoxia on

skeletal muscle growth and its mechanism of molecular regulation. Methods: SD rats were divided into 6 groups:(1) 28-days groups, included control group, normoxic exercise group, hypoxic exposure group, living high training low (HiLo) group.(2) 7-days reoxygen groups, included 7 days of reoxygen groups after hypoxic exposure,7 days of reoxygen groups after HiLo. Normoxic exercise group were carried out treadmill running for 4 weeks. Hypoxic exposure group were treated with 13.6% concentrations of oxygen for 12 h/day under normobaric conditions in hypoxic chamber. 7 days of reoxygen groups were treated with 7 days of reoxygen after hypoxic exposure. HiLo group were exposed to hypoxia following 1 hour after exercise. After gastrocnemius muscle weighing, mTOR expression in gastrocnemius muscle were tested with the method of western blot. Results: 1) After exercisefor 28 days, mTOR protein expression in muscle increased significantly（p<0.05）;2) After living high training low for 28 days, mTOR protein expression in muscle decreased significantly（p<0.05）, but increased significantly after 7 days reoxygen（p<0.05）. Conclusions: exercise and hypoxia regulate mTOR signal. HiLo repress muscle growth, and its mechanism may be the way of regulation of mTOR signal and protein translation in skeletal muscle by exercise and hypoxia.

Key words: hypoxia; living-high-training-low(HiLo); translation regulation; mammalian target of rapamycin (mTOR）

低氧運動抑制肌肉生長會導(dǎo)致骨骼肌丟失及力量下降等問題，但具體機制不清楚。肌肉生長的調(diào)控與基因表達的調(diào)控有關(guān)，基因表達的調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和翻譯的調(diào)控。翻譯是連接基因組和蛋白組的橋梁，翻譯的調(diào)控是基因表達的調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。

大量的細胞培養(yǎng)實驗表明低氧抑制蛋白合成，與mTOR信號有關(guān)。而低氧運動影響骨骼肌蛋白合成，但其機制不清楚。為了闡明低氧運動對蛋白合成的調(diào)控機制，本研究測試了高住低訓(xùn)大鼠骨骼肌mTOR蛋白表達變化，我們假設(shè)運動后mTOR蛋白表達增加，低氧及運動后mTOR表達下降。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 健康雄性、SPF級2月齡的SD大鼠(許可證號：SCXK(京)2002-0001 動物編號：0068277)，體重180～200 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。晝夜節(jié)律人工控制光照(光照時間為07:00-19:00)，環(huán)境溫度(23±2)℃，動物自由取食及飲水，飼養(yǎng)一周后用于實驗。實驗動物隨機分組，共分為6組：對照組（C）、常氧運動組（E）、低氧暴露組（H）、高住低訓(xùn)組（HL）；低氧暴露組、高住低訓(xùn)組又分為28 d組和復(fù)氧7 d組，每組6只。

1.2 運動與低氧暴露模型 運動組先進行適應(yīng)性訓(xùn)練6 d，坡度為5°，速度分別為10 m/min、15 m/min、20 m/min，進行強度遞增的適應(yīng)運動，每日1次，每次30 min；然后進行正式跑臺運動：上坡跑，跑臺坡度5°，速度20 m/min，60 min/次, 6次／周。常氧運動組大鼠在適應(yīng)性運動后進行正式跑臺運動4周，高住低訓(xùn)組運動4周（28 d組）或5周（復(fù)氧7 d組）。對照組均不運動，其生活條件與運動組相同。

采用間歇低氧暴露方式進行低氧暴露。使用人工低氧艙（美國Hypoxic Systems tent-1型低氧帳篷）模擬氧濃度13.6%（相當(dāng)于海拔高度3 500 m）低氧環(huán)境。打開低氧儀，讓低氧帳篷內(nèi)的氧濃度降到13.6%，并穩(wěn)定1 h后，將大鼠放入，進行低氧暴露。低氧暴露組白天生活在常氧環(huán)境，晚上進行低氧暴露12 h（20:00-8:00）。高住低訓(xùn)組于每天運動后1 h同時于同一低氧環(huán)境進行相同持續(xù)時間的低氧暴露。28 d低氧暴露組低氧暴露28 d，復(fù)氧7 d組在低氧暴露28 d后出低氧艙后剩余7 d不再進行低氧暴露。對照組、常氧運動組為常氧環(huán)境，不進行低氧暴露。

1.3 組織勻漿及總蛋白含量測定 大鼠低氧暴露后即刻取材。對大鼠進行25%烏拉坦腹腔麻醉，腹主動脈取血后，取右側(cè)后肢完整腓腸肌，去筋膜和脂肪等，稱重。用于勻漿的肌肉樣品，被切成重約100 mg大小，加10倍體積（1 mL）的預(yù)冷的勻漿緩沖液于玻璃勻漿器中冰上勻漿，靜置10 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP中。12 000 g 4℃ 離心10 min。取上清，用于總蛋白含量測定及western blot測定。

總蛋白含量采用BCA測試方法，按試劑盒（PIERCE）說明進行。

1.4 免疫印跡 取1份（100 μg）肌肉勻漿上清液，加入等體積的SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，使蛋白變性。將變性后的蛋白全部上樣，最右邊的一泳道加蛋白質(zhì)標(biāo)準。在5%的濃縮膠以20 mA恒流，10%的分離膠（或7.5%的分離膠）以40 mA恒流的條件下電泳約2 h。電泳結(jié)束后取出凝膠，采用濕轉(zhuǎn)的方法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后把NC膜放入含5% BSA（w/v）的封閉液培養(yǎng)皿中，于室溫輕搖1 h進行封閉。取出膜，裝入保鮮膜袋中，將用封閉液適當(dāng)稀釋過的一抗（mTOR為1:1 000購自cell signal）加入到NC膜，4℃振蕩孵育過夜封閉。將一抗孵育過的NC膜用TBST洗3次，15 min/次。取出NC膜，裝入保鮮膜袋中，將適當(dāng)稀釋過的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1:2 000，中杉金橋ZB-2 301)加入到NC膜，室溫振蕩孵育1 h。將二抗孵育過的NC膜用TBST洗3次，15 min/次。用ECL發(fā)光試劑（Santa Cruz No. sc-2048）發(fā)光，底片曝光，顯影、定影，掃描儀掃描，測定目的條帶光密度值。結(jié)果采用待測樣品目的條帶光密度與對照光密度比較相對值。

1.5 統(tǒng)計處理 實驗結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準差表示。全部統(tǒng)計學(xué)分析均采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行，組間比較采用方差分析，以P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 低氧暴露和運動對大鼠骨骼肌質(zhì)量的影響 常氧運動、低氧暴露及高住低訓(xùn)對大鼠腓腸肌重量影響見表1。常氧運動組、低氧暴露組及高住低訓(xùn)組28 d后肌肉質(zhì)量顯著低于常氧安靜組，其中高住低訓(xùn)組最低，低氧暴露組其次，常氧運動組最小（p<0.05）。與復(fù)氧前比，低氧暴露后復(fù)氧７ d，大鼠腓腸肌重量又顯著回升；高住低訓(xùn)后復(fù)氧７ d，大鼠腓腸肌重量也顯著回升（p<0.05）。

2.2 低氧暴露和運動對大鼠骨骼肌質(zhì)量的影響 實驗各組中都檢測到了289kD處蛋白條帶，表明mTOR存在著表達（圖1）。

持續(xù)28 d的變化。28 d后常氧運動組mTOR蛋白表達顯著上升，增加49.1%（p<0.05）；低氧暴露組和高住低訓(xùn)組，mTOR蛋白表達明顯下降，分別為86.6%，92.1%（p<0.05）（表1）。

注：結(jié)果為平均數(shù)±標(biāo)準差，n=6，a表示與對照相比有顯著差異，p<0.05；b表示與E組相比HL組有顯著差異，p<0.05；c表示與H組相比HL組有顯著差異，p<0.05；d表示與同組28 d比有顯著差異，p<0.05。

復(fù)氧7 d的變化。與28 d低氧暴露組比，低氧暴露再復(fù)氧7 d組mTOR表達顯著升高，為410%（p<0.05）；高住低訓(xùn)再繼續(xù)復(fù)氧運動7 d，mTOR表達比7 d前顯著增加，上升267%（p<0.05）（表2）。

注：結(jié)果為平均數(shù)±標(biāo)準差，n=6，a表示與對照相比有顯著差異，p<0.05；b表示與E組相比HL組有顯著差異，p<0.05；c表示與H組相比HL組有顯著差異，p<0.05；d表示與同組28 d比有顯著差異，p<0.05。

3 分析討論

3.1 高住低訓(xùn)后骨骼肌質(zhì)量下降 本研究發(fā)現(xiàn)，28 d高住低訓(xùn)導(dǎo)致肌肉質(zhì)量顯著下降，復(fù)氧7 d后肌肉質(zhì)量顯著回升，表明高住低訓(xùn)對骨骼肌生長友明顯的抑制。這可能與低氧和運動兩種因素都有關(guān)。有報道大鼠6周的低氧暴露和低氧訓(xùn)練時肌肉重量下降^［1］，本實驗也觀察到安靜低氧暴露導(dǎo)致肌肉含量顯著下降。運動對肌肉質(zhì)量影響與運動方式有關(guān)^［2］，一般抗阻力運動導(dǎo)致肌肉的肥大，而耐力運動對肌肉的肥大沒有明顯的作用。我們的研究表明運動28 d耐力運動后肌肉含量也有一定程度的下降，但幅度比高住低訓(xùn)小。

肌肉質(zhì)量的下降表明低氧運動影響蛋白代謝。因為肌肉質(zhì)量的下降包括液體成分和蛋白的丟失，因而蛋白的狀況會受影響。

3.2 高住低訓(xùn)后骨骼肌mTOR蛋白表達下降 mTOR即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其活性可被一種鏈霉菌的衍生物雷帕霉素（rapamycin）所阻斷。許多學(xué)者認為mTOR是目前除了AMPK之外的又一個對能量敏感的感受器，能監(jiān)測細胞內(nèi)AMP濃度的變化。在細胞的生長、分化、增殖、遷移和存活上扮演了重要的角色。mTOR是一種大分子蛋白質(zhì)，分子量為289 kDa，由2 459個氨基酸分子組成。mTOR蛋白氨基酸組成非常保守，人、大鼠的mTOR之間有95%的氨基酸一致^［3］。

mTOR可以感受細胞能量狀況（AMP/ATP）、環(huán)境中營養(yǎng)狀況以及生長因子刺激信號傳遞途中的PI3K信號。激活后的mTOR再將信號傳遞給下游三種主要靶蛋白p70S6K、4E-BP1、eIF4G，這些靶蛋白是蛋白質(zhì)合成的重要調(diào)控因子，能激活蛋白質(zhì)的合成。因此mTOR對于蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的形成、核糖體的生成以及多肽鏈的延伸等蛋白質(zhì)翻譯過程正常進行起著至關(guān)重要的作用。

一些研究表明，運動及電刺激等引起肌肉負荷增加會刺激骨骼肌mTOR磷酸化及總蛋白表達^［4］。Parkington^［5］報道對坐骨神經(jīng)進行高頻電刺激后即刻趾肌中mTOR磷酸化增加3.4倍（p<0.01）,脛骨前肌中沒有變化；6 h后趾肌和脛骨前肌mTOR磷酸化都保持較高水平。2003年Bolster^［6］研究了急性阻力運動后PKB/mTOR信號通道各時相的變化情況。結(jié)果表明在急性阻力運動后腓腸肌內(nèi)PKB、mTOR、p70s6k的磷酸化在運動恢復(fù)后10 min達到了峰值，此時與對照相比PKB磷酸化增加282%、mTOR增加240%、p70s6k 增加292%。Leger等^［7］人發(fā)現(xiàn),8周抗阻運動后mTOR磷酸化水平分別顯著增加44%,在停止運動8周后,mTOR磷酸化水平保持在較高水平。分析上述引起骨骼肌mTOR來磷酸化及總蛋白水平上升的刺激因素發(fā)現(xiàn)，這些因素都與促進骨骼肌肥大相關(guān)。有關(guān)耐力運動對mTOR蛋白表達的影響甚少。有關(guān)耐力運動后骨骼肌mTOR水平研究很少，由研究表明老年小鼠3個月耐力運動后小鼠腓腸肌總mTOR水平增加^［8］，與上述結(jié)果一致，本研究顯示２８ d常氧運動組mTOR蛋白表達顯著上升，增加49.1%（p<0.05），表明耐力運動后骨骼肌總mTOR水平上升。分析上述的研究發(fā)現(xiàn)mTOR表達可能與運動方式由關(guān)，即能促進骨骼肌的肥大抗阻力運動可能是刺激mTOR水平的運動方式。我們所采用的運動方式雖然為大鼠跑臺運動，但這種運動方式也能促進骨骼肌蛋白合成^［9］。

低氧暴露抑制機體蛋白質(zhì)合成^［10］。低氧抑制蛋白質(zhì)合成可能因為低氧暴露降低ATP濃度，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成抑制；低氧訓(xùn)練對蛋白質(zhì)合成代謝的影響的機制不太清楚，可能存在多種作用途徑。吸入體內(nèi)的氧濃度高低和低氧暴露時間的長短可能直接的調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成。O2濃度對蛋白質(zhì)合成非常重要，蛋白質(zhì)的生物合成特別是起始階段是一個非常耗能的過程，缺氧會導(dǎo)致肌細胞利用氧的減少，能量缺乏，使骨骼肌蛋白質(zhì)的合成受阻。運動后的恢復(fù)期對蛋白合成代謝的影響至關(guān)重要，因為運動期蛋白分解加強合成抑制，而運動后恢復(fù)其蛋白合成加強，分解減弱。低氧運動后的的低氧環(huán)境可能導(dǎo)致恢復(fù)不充分影響蛋白合成。有研究表明低氧抑制蛋白翻譯過程，而mTOR參與其中^［11,12］。但有關(guān)研究主要為細胞研究，即采用細胞培養(yǎng)的方法對生長中細胞mTOR信號的影響，而有關(guān)活體研究的海很少報道。我們研究對象為大鼠，結(jié)果顯示大鼠低氧暴露28 d后骨骼肌mTOR表達下降86.6%，復(fù)氧mTOR表達顯著升高，為410%（p<0.05），表明低氧暴露對mTOR表達有明顯的抑制作用，研究結(jié)果與細胞實驗的結(jié)果是相符的。本研究提示低氧對大鼠骨骼肌生長的抑制機制可能與mTOR信號變化有關(guān)。

目前還沒有任何有關(guān)低氧復(fù)合運動對mTOR信號影響的報道^{［13，14］}。我們首次研究了低氧復(fù)合運動對mTOR表達的影響。結(jié)果表明28 d高住低訓(xùn)組mTOR蛋白表達明顯下降，為92.1%（p<0.05），在復(fù)氧7 d后繼續(xù)運動，mTOR表達又顯著回升，上升267%（p<0.05）。研究結(jié)果表明高住低訓(xùn)顯著抑制mTOR表達，提示低氧運動對大鼠骨骼肌生長的抑制機制可能通過抑制mTOR表達而調(diào)控蛋白的翻譯過程。

4 結(jié) 論

耐力運動28 d后大鼠骨骼肌mTOR蛋白表達明顯增加。28 d高住低訓(xùn)導(dǎo)致肌肉質(zhì)量顯著下降，復(fù)氧7天后肌肉質(zhì)量顯著回升，骨骼肌生長被明顯抑制。28 d高住低訓(xùn)后骨骼肌mTOR蛋白表達明顯下降，復(fù)氧7 d后又顯著回升。提示高住低訓(xùn)調(diào)控骨骼肌生長的分子機制可能在于通過運動、低氧影響mTOR蛋白表達進而調(diào)控骨骼肌蛋白翻譯過程。

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