間歇低氧訓練活性氧介導基因調(diào)控作用的研究

黃麗英　翁錫全　林　文

摘要：目的：試圖從活性氧（ROS）角度出發(fā)，探討間歇低氧訓練對低氧敏感基因及相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)作用的機制,為運動與低氧適應(yīng)提供理論依據(jù)。方法：采用二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH睤A）熒光探針觀察線粒體ROS的變化，利用RT睵CR技術(shù)研究心肌組織低氧誘導因子1(（HIF1α）、原癌基因（c瞗os）、MnSOD和腎臟組織EPO基因的mRNA表達水平的變化。結(jié)果：低氧應(yīng)激后ROS產(chǎn)生增多，經(jīng)過4周的間歇低氧訓練適應(yīng)后再低氧應(yīng)激， ROS的產(chǎn)生減少；低氧應(yīng)激后 HIF1α、EPO、c瞗os、MnSOD基因表達增加，間歇低氧訓練適應(yīng)后這些基因指標較常氧組呈顯著性上升（p<0.05）。結(jié)論：ROS作為低氧應(yīng)激和運動應(yīng)激的靶點之一引起細胞氧化應(yīng)激，其產(chǎn)生又能激活核因子HIF1α，使一些相關(guān)低氧敏感基因EPO、MnSOD、c瞗os的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，促使其轉(zhuǎn)錄及mRNA表達增強。這些基因指標的變化規(guī)律與ROS的變化相吻合，表明HIF1α、EPO、c瞗os、MnSOD基因的表達與低氧適應(yīng)有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：間歇低氧訓練；大鼠；活性氧；基因調(diào)控

中圖分類號：G804.21文獻標識碼：A文章編號：1007-3612(2008)05-0615-03

活性氧（ROS）作為細胞毒素的作用已被人們基本認可。除了其負面的損傷作用，ROS也積極參與對細胞信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控。大量研究證明，ROS參與許多重要的生命過程，如細胞增殖與分化、細胞凋亡、腫瘤的誘發(fā)與抑制、肌肉收縮、神經(jīng)傳導、細胞吸附、基因表達等均與ROS有著密切的關(guān)系。在間歇低氧訓練中ROS的產(chǎn)生是否也充當?shù)诙盘柗肿咏閷Щ虮磉_呢？它又是如何介導基因調(diào)控的呢？這方面尚未見有文獻報導，本文實驗試圖從ROS角度出發(fā)，探討間歇低氧訓練對低氧敏感基因及相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)作用的機制,為運動與低氧適應(yīng)提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1動物模型8周齡雄性SD大鼠70只，隨機分為7組，分別為：1） 常氧安靜組；2） 常氧訓練組；3） 急性低氧安靜組；4） 急性低氧運動組；5） 急性低氧訓練組；6） 間歇低氧安靜組和；7） 間歇低氧訓練組，每組大鼠10只。6、7組每天20:00-次日8:00居住在常壓低氧艙中（14.5%含氧量，采用的設(shè)備為美國Hypoxicon公司制造），共12 h，其余時間在艙外常氧中訓練或自由活動，訓練組（2）、（5）、（7）每天在艙外于動物跑臺以25 m/min運動、1 h/d、5 d/周，共4周。（3-7）組采樣前進行12 h低氧應(yīng)激，（4）組低氧應(yīng)激前進行1 h25 m/min運動。飼料由中山大學醫(yī)學院動物實驗中心提供，飲水為凈化自來水，自由攝食、飲水，環(huán)境溫度及光照時間正常。

1.2研究方法

1.2.1線粒體活性氧(ROS)的測定(DCFH-DA法)［4］

1.2.2基因表達RT-PCR一步法。

1.2.2.1RT-PCR試劑美國Invitrogen公司SuperScript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase。

1.2.2.2引物下面引物設(shè)計采用OMIGA2.0軟件,在gene bank 中可查到。

1.2.2.3反應(yīng)條件48℃ 25 min；94℃2 min；94℃ 15sec；55℃ 30sec；72℃ 1 min；32個循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.2.2.4結(jié)果計算和統(tǒng)計處理凝膠電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進行電泳條帶光密度分析。標本靶基因條帶光密度參數(shù)與內(nèi)參基因（GAPDH）條帶的光密度參數(shù)之比值作為該標本mRNA的表達水平參數(shù)，在WINDOWS FOR SPSS11.0軟件上進行統(tǒng)計，采用獨立樣本玊檢驗，以平均數(shù)±標準差(Means±SD)來表示。

2結(jié)果

2.1低氧應(yīng)激對大鼠心肌線粒體ROS的影響

由表1可知，急性低氧應(yīng)激后，心肌ROS呈上升趨勢。與常氧安靜組相比，急性低氧安靜組（組3）均顯著升高（玴<0．05），急性低氧運動組（組4）均呈極顯著升高（p<0.01）；與常氧訓練組相比，組4均呈極顯著升高（p<0.01）；與急性低氧運動組相比，組5和組7均顯著下降（p<0.05）。

2.2低氧應(yīng)激對大鼠各基因 mRNA表達的影響

2.2.1低氧應(yīng)激對大鼠心肌HIF-1α mRNA表達的影響從圖1可見，與常氧安靜組比較，各組HIF-1α mRNA表達水平上調(diào)，且急性低氧訓練組有極顯著性差異（玴<0.01），除常氧訓練組外，其它各組之間均有顯著性差異（玴<0.05）。

2.2.2低氧應(yīng)激對大鼠腎臟EPO mRNA表達的影響從圖2可見，與常氧安靜組比較，急性低氧安靜組和間歇低氧訓練組都有顯著性差異（玴<0.05），急性低氧運動組有極顯著上升（p<0.01）；與常氧訓練組相比，急性低氧運動組呈顯著性上升（p<0.05）；與急性低氧訓練組相比，急性低氧運動組上調(diào)明顯（p<0.05）。

2.2.3低氧應(yīng)激對大鼠心肌轉(zhuǎn)錄因子c-fos基因表達的影響從圖3可見，與常氧安靜組比較，除常氧訓練組外，其余各組c-fos mRNA表達水平上調(diào)均顯著（玴<0.05），且急性低氧運動組、急性低氧安靜組和間歇低氧訓練組均有極顯著性差異（p<0.01）；與常氧訓練組相比，急性低氧運動組極有顯著上升（p<0.01），間歇低氧訓練組有顯著性增加（p<0.05）；與急性低氧訓練組相比，急性低氧運動組上調(diào)明顯（p<0．05）。

2.2.4低氧應(yīng)激對大鼠心肌MnSOD mRNA表達的影響從圖4可見，與常氧安靜組比較，急性低氧運動組和間歇低氧訓練組均有顯著性升高（玴<0.05）；與急性低氧訓練組相比，急性低氧運動組上調(diào)明顯（p<0.05）。

3討論

線粒體是氧代謝的主要部位,是氧感受和信號轉(zhuǎn)導途徑之一。Chandel等［5］實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧時ROS產(chǎn)生增加,本文實驗發(fā)現(xiàn)低氧應(yīng)激線粒體ROS產(chǎn)生增加,急性低氧應(yīng)激與一次性急性運動負荷后，線粒體ROS劇增，可見這是由于低氧應(yīng)激產(chǎn)生的ROS與運動產(chǎn)生的ROS疊加的結(jié)果。段春禮等實驗結(jié)果證明ROS的適應(yīng)性參與缺氧耐受性的形成,本實驗觀察到大鼠經(jīng)過4周的低氧適應(yīng)后再急性低氧應(yīng)激，心肌線粒體ROS的產(chǎn)生較一次急性低氧應(yīng)激少，同時我們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氧與運動訓練適應(yīng)后較單純低氧適應(yīng)效果好。

ROS過多對細胞產(chǎn)生毒害作用,引起脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、蛋白質(zhì)交聯(lián)和-SH基氧化。ROS作為信號分子,在細胞氧濃度變化與有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)與功能的反應(yīng)性變化之間,提供一種化學連接，這種信號傳遞的最佳方式是對蛋白質(zhì)-SH基氧化還原的調(diào)制。其中氧還態(tài)的化學調(diào)制包括NF-(B、c-fos以及HIF-1等許多重要的轉(zhuǎn)錄因子。O2.-經(jīng)Fenton反應(yīng)形成活性氧中間體，可使HIF-1的—SH氧化為—SS而影響HIF-1活性，導致蛋白質(zhì)的巰基由氧化型向還原型轉(zhuǎn)變，促使決定HIF-1活性的亞基HIF-1α與HIF-1β形成二聚體,激活其結(jié)合DNA的活性。活化的HIF-1參與對其它分子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,從而啟動了細胞的低氧反應(yīng)基因系統(tǒng)，使一些相關(guān)低氧敏感基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，促使一些基因的轉(zhuǎn)錄及表達增強。本實驗觀察到低氧應(yīng)激能使HIF-1(基因表達水平上升，與文獻報導一致［6］。Halterman認為中度缺氧可使HIF-1α復合物穩(wěn)定,引起應(yīng)答基因表達。本實驗觀察到間歇低氧訓練持續(xù)4wk后HIF-1α mRNA的表達增加，可能是適度的低氧反復刺激和運動訓練的適應(yīng)，使HIF-1α 基因產(chǎn)生了適應(yīng)。HIF-1可能直接受ROS的調(diào)控，低氧時HIF-1α蛋白水平和HIF-1DNA結(jié)合活性增加，調(diào)節(jié)許多低氧反應(yīng)基因的表達，成為細胞氧平衡和低氧反應(yīng)基因表達的一個中心調(diào)節(jié)因子。低氧時HIF-1α蛋白水平增加、入核、二聚化，結(jié)合于低氧反應(yīng)基因中的低氧反應(yīng)元件上的HIF-1結(jié)合位點，促進低氧氧敏感基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1調(diào)控的主要靶基因有：EPO、MnSOD、c-fos等。低氧調(diào)節(jié)EPO基因表達是一個十分復雜的過程,涉及EPO基因上許多順式調(diào)節(jié)元件以及其上特異結(jié)合的反式作用因子，低氧主要是通過提高HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性,促進HIF-1α與EPO基因3增強子中的Site 1相結(jié)合,調(diào)節(jié)EPO基因表達。本實驗觀察到間歇低氧訓練組EPO mRNA表達水平顯著性升高（玃<0.05），這與文獻報導一致。Macaya等實驗結(jié)果表明腦在缺血再灌過程中ROS增加，誘導c-fos、c-Jun mRNA 基因表達［3］。Russell等報導肺在缺氧后MnSOD活性和MnSOD mRNA的表達減少；轉(zhuǎn)基因鼠在低氧條件下較正常鼠MnSOD mRNA表達量高［7］。本實驗觀察到急性低氧使抗氧化酶基因表達增加，這可能是機體代償性升高，機體自我保護的現(xiàn)象。張敏等研究表明，大鼠在低壓氧環(huán)境下進行反復短暫的高強度運動，心肌CuZnSOD mRNA的表達增高，認為是心臟適應(yīng)性的變化。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4wk的間歇低氧適應(yīng)后機體抗氧化酶MnSOD mRNA表達整體水平提高，間歇低氧運訓練效果更明顯，表明經(jīng)過低氧與運動訓練的適應(yīng)能提高機體抗氧系統(tǒng)的能力，有效清除低氧時ROS的產(chǎn)生，使機體得到保護。以上基因的表達與低氧適應(yīng)有密切關(guān)系。HIF-1作為基因轉(zhuǎn)錄的生理調(diào)節(jié)因子,是對低氧適應(yīng)的重要中介因子,是與紅細胞生成、血紅蛋白增加、血管生長、血流供應(yīng)、氧化和能量代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和表達密切相關(guān)的一個重要調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，低氧應(yīng)激ROS產(chǎn)生可使HIF-1α基因表達增加，使一些相關(guān)低氧敏感基因EPO、MnSOD、c-fos的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，促使其轉(zhuǎn)錄及mRNA表達增強。HIF-1可能直接受ROS的調(diào)控。ROS作為低氧應(yīng)激和運動應(yīng)激的靶點之一引起細胞氧化應(yīng)激，其產(chǎn)生又能激活核因子HIF-1，從而誘導EPO、MnSOD等抗氧化酶基因的表達，可見間歇低氧訓練中ROS充當?shù)诙盘柗肿咏閷Щ虮磉_。這些基因指標的變化規(guī)律與ROS的變化相吻合，表明HIF-1α、EPO、c-fos、MnSOD基因的表達與低氧適應(yīng)有密切關(guān)系。低氧環(huán)境條件下ROS產(chǎn)生增加，使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，由于ROS通過信號傳導通路激活轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄,通過它再誘發(fā)應(yīng)答靶基因的較高水平轉(zhuǎn)錄和表達,導致一系列抗氧化酶及DNA修復酶活性增強和其它蛋白質(zhì)的變化,從而提高低氧的適應(yīng)能力。

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