應(yīng)用ＲＴ－ＰＣＲ分子檢測技術(shù)快速檢測大蒜普通潛隱病毒

張　威　張勻華　李學(xué)湛　高艷玲　白艷菊

摘要：根據(jù)大蒜普通潛隱病毒(Gdrlic common latent virus，GCLV)的外殼蛋白區(qū)域的保守序列設(shè)計合成一對寡核苷酸引物，以帶毒植物的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，通過反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的建立與優(yōu)化，擴增得到長300 bp的目的片段，并將目的片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行了克隆和序列測定。測序結(jié)果與GenBank中其他GCLV相應(yīng)區(qū)域的序列同源性最高達(dá)98％。并對其檢測的特異性和靈敏度進(jìn)行了驗證，從而建立了快速、靈敏、特異性強的GCLV分子生物學(xué)檢測方法。

關(guān)鍵詞：大蒜普通潛隱病毒；反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；病毒檢測

中圖分類號：Q 814．9

大蒜為無性繁殖作物，病毒病危害相當(dāng)嚴(yán)重，根據(jù)1989年walkey報道，感毒大蒜產(chǎn)量損失可達(dá)50％，且病毒一旦侵入很難脫除，常因鱗莖母體帶毒而垂直傳染給后代，引起種性退化而最終毀種。

目前侵染大蒜的病毒主要是馬鈴薯Y病毒屬、香石竹潛隱病毒屬、青蔥X病毒屬成員，其中香石竹潛隱病毒屬成員中的CCLV為侵染大蒜的主要病毒之一。它為單鏈正性RNA病毒，基因組RNA包裹在長度為610～690 nm的線狀病毒粒子中，由蚜蟲以非持久方式傳播。此病毒在荷蘭、德國、日本、印度尼西亞、韓國和中國都有報道。

由于多數(shù)寄主植物受GCLV侵染后不表現(xiàn)明顯癥狀，病原檢測顯得更為重要。傳統(tǒng)的檢測方法是指示植物鑒定和DAS ELISA法。指示植物鑒定周期長、季節(jié)性強、癥狀易混淆，DAS-ELISA法易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。而反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)可以在病毒的特異性引物作用下對其進(jìn)行擴增，從而提高了病毒檢測的特異性與靈敏度。ThorV.M.Fajardo等人應(yīng)用此技術(shù)對巴西地區(qū)大蒜上的馬鈴薯Y病毒屬和香石竹潛隱病毒屬的幾種病毒進(jìn)行了鑒定，F(xiàn).Takaki等人對洋蔥黃矮病毒的弱毒株系進(jìn)行RT-PCR全序列擴增。但是，在國內(nèi)運用此技術(shù)直接檢測GCLV的還未見報道。因此本試驗設(shè)計了一對寡核苷酸引物，并對影響RT-PCR反應(yīng)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了快速檢測GCLV的RT-PCR檢測體系，從而為GCLV的早期鑒定及病害普查提供了快捷的檢測手段。

1材料與方法

1．1材料

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所保存的大蒜普通潛隱病毒(GCLV)、韭蔥黃條病毒(LY-sV)、青蔥潛隱病毒(SLV)、洋蔥黃矮病毒(OYDV)。將毒源接種于大蒜的繁殖寄主蔥屬植物上，置于溫室中觀察發(fā)病情況，經(jīng)DAS-ELISA法檢測病毒達(dá)到高峰期采收，保存于-80℃條件下備用。大腸桿菌(Escherichia coli)GM109由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗室提供，PMDl8-T購自TaKaRa(大連)公司。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶、EcoR I、sal I購自寶生物工程(大連)有限公司，dNTP購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，B型質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒、B型小量DNA片段快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。引物合成及序列測定委托上海生工生物工程有限公司完成。

1．2方法

1．2．1GCLV特異性引物的設(shè)計

以日本的GCLV核苷酸序列(GenBank中的登錄號：AB004804)為查詢序列，在NCBI的BLAST系統(tǒng)進(jìn)行同源性比對，選擇GCLV外殼蛋白區(qū)域的保守序列利用引物設(shè)計軟件Primer Premier5．0進(jìn)行引物設(shè)計，合成了一對引物：A1：5-GTG-GTTTGGAATGAAAT-3，A2：5-GGATC-CATTGAAGTTTGT-3。

1．2．2病毒總RNA的提取

取50 mg感病組織于1.5 mL Eppendorf管中，在液氮狀態(tài)下研磨，加入600 μL提取緩沖液(50 mmol／LTris-HCl，pH 8.0；140 mmol／L NaCl；10 mmol／L EDTA；1％SDS；2％PVP；10U RNasin；2％巰基乙醇，后兩種現(xiàn)用現(xiàn)加)，離心去渣取上清；加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，混勻，離心取上清；再加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，混勻，離心取上清；再加入2.5倍體積的無水乙醇和1／10體積的3 mol／L的NaAc，混勻，一20℃放置3 h后，離心，棄上清，最后用無水乙醇洗2次，真空干燥，溶于40 μL TE中備用。

1．2．3RT-PCR擴增

第1輪RT-PCR反轉(zhuǎn)錄體系：1.1 mmol／L的dNTP、2.5 μL的5×buffer、9.5U的RNasin、45.0U的RTase，總體積為10 μL，于42℃反應(yīng)1 h；第2輪PCR反應(yīng)體系：加入DNA模板4.0 μL、上下游引物各22.0 ng、2.3 mmol／L的MgC1₂、0.2 mmol／L的dNTP、1.0I的TaqDNA聚合酶、2.3 μL的10×buffer，總體積為25 μL。PcR反應(yīng)程序設(shè)置：94℃，5 min；然后94℃，1 min；55℃，1 min；72℃，1 min，反應(yīng)35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QIAEXⅡGel Exreaction Kit(QIAGEN)回收純化。

1．2．4目的基因的克隆與序列測定

將PcR擴增產(chǎn)物純化后連接到PMD18-T Eas-y Vector上，轉(zhuǎn)化到通過CaCl₂法制備的GM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取加有Amp的LB平板上的單菌落，應(yīng)用B型質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒提取質(zhì)粒，利用Ecol I和Snz工對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。GCLV的目的片段委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測定。

2結(jié)果與分析

2．1GCLV總RNA的提取

要進(jìn)行核酸雜交、RT-PCR等分子生物學(xué)研究，都必須有純度較高、完整性較好的核酸。純的核酸OD₂₆₀nm／OD₂₈₀nm應(yīng)大于1.700，表明植物組織中的酚類化合物、多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)抽提充分。本試驗采用SDS法提取的植物總RNA，測得的OD₂₆₀nm／OD₂₈₀nm的值都在1.740以上，說明樣品核酸提取的純度及完整性均較好，見表1。

2．2GCLV的RT-PCR初步擴增

以帶毒植物的總RNA為模板，利用GCLV的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增，得到了長度約為300 bp的目的片段與引物設(shè)計的片段大小一致，見圖1。

2．3GCLV的RT-PCR檢測體系的優(yōu)化

2．3．1PCR部分引物用量的優(yōu)化

為減少非特異性條帶和降低試劑成本，對PCR部分的試劑用量進(jìn)行了優(yōu)化。

首先應(yīng)用上述體系對引物用量在12.0～22.0 ng進(jìn)行RT-PCR擴增效果比較，由圖2可以看出，引物量在12.0 ng時引物二聚體基本消失，所以引物的最佳用量為12.0 ng。

2．3．2MgCl₂濃度優(yōu)化

MgCl₂濃度對RT-PCR的擴增效果影響較大，為了減少非特異性條帶的影響，對MgCl₂濃度在1.5～3.0 mmol／L的范圍內(nèi)進(jìn)行比較，由圖3可以看出當(dāng)MgCl₂濃度為1.5 mmol／L時擴增不到目的條帶，隨著濃度的增加目的條帶的亮度增加，但非特異性條帶的亮度也逐漸增加，且在目的條帶的上下出現(xiàn)非特異性條帶，由此可見，當(dāng)MgCl₂濃度為2.0 mmol／L時擴增效果最佳。

2．3．3Taq酶用量比較

PCR反應(yīng)是在TaqDNA聚合酶的催化下進(jìn)行的，對PCR的擴增結(jié)果影響較大，且價格也較昂貴，所以應(yīng)盡量減少其用量而得到最佳的效果，試驗結(jié)果如圖4可知，當(dāng)Taq酶量為0.7U時目的條帶最亮。

2．4GCLV的RT-PCR產(chǎn)物的克隆

為了進(jìn)一步驗證所擴增的目的片段，對其進(jìn)行回收，經(jīng)純化后克隆到PMD18-T Easy Vector上，轉(zhuǎn)人大腸桿菌，挑取LB平板上的單菌落，試劑盒提取質(zhì)粒，最后雙酶切驗證得到了含有插入片段的重組子，見圖5。

2．5目的片段的序列測定及同源性比較

對重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行了測序，結(jié)果得到了長度為300 bp的目的片段，樣品的序列與GenBank中發(fā)表的GCLV分離物的相應(yīng)區(qū)域基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明核苷酸序列同源性最高可達(dá)98％，最低為90％，氨基酸序列同源性最高可達(dá)97％，最低為91％，證明所克隆的片段為GCLV外殼蛋白保守序列的一部分。其中所測序列與GCLV引物設(shè)計序列(GenBank中的序列號：AB004804)相應(yīng)區(qū)域的同源性為96％，比對結(jié)果見圖6。

2．6RT-PCR檢測的特異性與靈敏度

2．6．1RT-PCR檢測的特異性

應(yīng)用該檢測體系可以從感染GCLV的大蒜樣品中擴增得到300 bp的目的條帶，而經(jīng)常與GCLV復(fù)合侵染大蒜的LYSV、SLV、OYDV的陽性對照均無此條帶，見圖7。

2．6．2RT-PCR檢測的靈敏度

將總核酸按10倍梯度稀釋，試驗結(jié)果如圖8可知，該體系擴增的靈敏度為10^-4病毒稀釋液，相當(dāng)于檢測到100 ng感病組織中的GCLV。

3討論

大蒜病毒病往往是由多種病毒的復(fù)合侵染所致，具有相似的特征，很窄和重疊的實驗寄主范圍，并且在感病的寄主上表現(xiàn)相似的癥狀。這些生物學(xué)特征降低了通過指示植物對大蒜病毒進(jìn)行鑒定的準(zhǔn)確性。另外大蒜病毒的傳播途徑、病毒寄主范圍、體外保毒期、稀釋限點、鈍化溫度、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體形態(tài)等生物學(xué)指標(biāo)也可作為病毒鑒定標(biāo)準(zhǔn)，但這些方法耗時長，且鑒定有效性差。而用血清學(xué)方法鑒定大蒜病毒仍是目前通常采用的方法，但已有研究表明，利用血清學(xué)技術(shù)進(jìn)行病毒種的鑒定時結(jié)果很不可靠，同屬病毒問外殼蛋白氨基酸序列同源性較高，導(dǎo)致不同種病毒的抗血清常常會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而造成假陽性的出現(xiàn)，所以利用快速、靈敏、特異性強的RT-PCR分子檢測技術(shù)來檢測大蒜病毒顯得尤為重要。

本試驗根據(jù)GCLV的核苷酸保守序列設(shè)計合成了一對引物，建立了GCLV的RT-PCR分子檢測體系，并對影響PCR反應(yīng)的主要試劑用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)引物用量為12 ng，MgCl₂濃度為2.0 mM，Taq酶用量為0.7U時目的片段的亮度達(dá)到最佳，基本消除了非特異條帶的干擾，且減少了Taq酶用量使檢測體系更加經(jīng)濟。

本試驗為了進(jìn)一步證實擴增的目的片段與理論設(shè)計的片段相符，從而對目的片段進(jìn)行了克隆和序列測定。測序結(jié)果與GCLV的其他分離物相應(yīng)區(qū)域的序列同源性最高達(dá)98％，證明所克隆的片段為GCLV核苷酸保守序列的一部分。

由于同屬病毒之間及侵染同一植株的不同病毒之間的序列可能會存在一定的同源性，所以本試驗對GCLV檢測體系的特異性進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明該體系對經(jīng)常與GCLV復(fù)合侵染大蒜的LYSV、SLV、OYDV的陽性對照均不能得到擴增，表明GCLV檢測體系的特異性較強。該檢測體系的靈敏度為10^-4病毒稀釋液，相當(dāng)于檢測到100 ng感病組織中的GCLV，其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清學(xué)檢測，且可以在2 h內(nèi)完成整個檢測過程，這為大蒜脫毒苗的檢測和大田病害的早期診斷提供了更加快速準(zhǔn)確的檢測方法。此檢測體系也為進(jìn)一步擴增病毒的基因組全序列，構(gòu)建病毒的系統(tǒng)進(jìn)化樹及區(qū)分同屬病毒不同種之間的差異和不同屬病毒之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。