植物病原菌ＳＳＲ標(biāo)記開發(fā)與利用

徐靜靜　藺　宇　朱振東

摘要：SSR標(biāo)記具有共顯性、高多態(tài)性、位點?；?、穩(wěn)定性好、操作技術(shù)簡單等特點，是十分理想的分子標(biāo)記。隨著一些簡單、經(jīng)濟和高效的ssR分離技術(shù)的發(fā)展，SSR標(biāo)記已逐漸在植物病原菌中被開發(fā)和利用。本文綜述了植物病原菌中SsR標(biāo)記的主要開發(fā)策略及其應(yīng)用進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：植物病原菌；SSR標(biāo)記；開發(fā)；利用

中圖分類號：S 432．1

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSRs)又稱微衛(wèi)星(microsatellites)，是基因組序列中以1～6個核苷酸為基本重復(fù)單元的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，普遍存在于真核和原核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。sSR分子標(biāo)記具有高多態(tài)性、多等位性、共顯性、分類學(xué)?；浴⒎€(wěn)定性好、操作技術(shù)簡單等特點，是十分有用的遺傳標(biāo)記，目前已廣泛應(yīng)用于動、植物遺傳圖譜構(gòu)建、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究、品種及基因型鑒定、目的基因及QTL的標(biāo)記和標(biāo)記輔助選擇育種等研究。然而，常規(guī)的SSR標(biāo)記開發(fā)一般是通過構(gòu)建、篩選基因文庫和測序等步驟完成，不但花費大，而且費工費時，因而限制了它在植物病原菌中的應(yīng)用。近幾年來一些新的SSR分離技術(shù)被發(fā)展，這些技術(shù)克服了傳統(tǒng)SSR分離方法的缺點，簡單有效，使植物病原菌SSR標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用成為可能。一些包括卵菌、真菌、線蟲和細(xì)菌在內(nèi)的植物病原菌SSR標(biāo)記被陸續(xù)開發(fā)(表1)，并應(yīng)用到研究的許多方面。

1植物病原菌中SSR標(biāo)記開發(fā)的主要策略

1．1基于傳統(tǒng)SSR標(biāo)記開發(fā)技術(shù)

傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記方法由Rassmann等發(fā)明。利用該方法開發(fā)SSR需要構(gòu)建和篩選基因組文庫，花費大量的人力、物力和財力，且效率較低，因此在植物病原菌中應(yīng)用很少。迄今，僅有Lepto-sphaeria maculans、Sclerotinia sclerotiorum和Phytophthora in festans少量的SSR標(biāo)記是通過該方法建立的。如Sirjusingh等通過構(gòu)建S.sclero-tiorum基因組文庫，用T4多核苷酸激酶和PrATP末端標(biāo)記的含有(TC)₁₀(TG)₁₀、(TGTA)₆TG、CT(ATCT)₆、CT(CCT)₅和(CAC)₅CA寡核苷酸探針進(jìn)行雜交篩選，陽性克隆用M13通用引物擴增，并測序插入片段，獲得20多個SSR標(biāo)記。

1．2利用SSR富集文庫篩選SSR標(biāo)記

直接從基因組文庫中篩選SSR位點效率較低。為了提高篩選效率，一些研究者建議通過構(gòu)建SSR富集文庫篩選SSR標(biāo)記。富集SSR文庫的構(gòu)建方法主要有兩種，一種是基于引物延伸的方法，一種是選擇性雜交方法，這兩種方法zane等已進(jìn)行了詳細(xì)綜述。由于SSR篩選效率的顯著提高，目前多數(shù)植物病原菌的SSR標(biāo)記是通過構(gòu)建SSR富集文庫獲得的。

基于引物延伸構(gòu)建SSR富集文庫的方法主要有兩種。這兩種方法首先都是將小基因組DNA片段插入到噬菌體質(zhì)粒嵌合體或噬菌體載體構(gòu)建單鏈DNA(ssDNA)初級文庫，接著以ssDNA作為模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，所用引物為特異重復(fù)寡核苷酸，只有含有目標(biāo)重復(fù)序列的載體中產(chǎn)生雙鏈DNA產(chǎn)物，但在恢復(fù)引物延伸產(chǎn)物程序上兩種方法存在差異。用引物延伸的方法構(gòu)建SSR富集文庫開發(fā)SSR標(biāo)記在動、植物中有一些應(yīng)用，在植物病原菌中目前只有Chen等用該方法分離了幾個Phialopho-ra gregata的SSR標(biāo)記。

不同于引物延伸方法，選擇性雜交構(gòu)建SSR富集文庫是將小基因組DNA片段連接到已知的DNA序列、載體或接頭上，接著與固定在尼龍膜上的SSR探針或結(jié)合在鏈霉親合素包被磁珠上的生物素標(biāo)記SSR探針雜交，雜交后用洗液洗幾次去除非特異性結(jié)合片段，再將DNA片段洗脫下來，PCR擴增恢復(fù)片段濃度，最后將DNA克隆到合適的載體上獲得SSR富集文庫。目前，絕大多數(shù)植物病原菌的SSR標(biāo)記是通過該方法獲得的。如Prospero等通過選擇性雜交方法構(gòu)建Phytophthora ramorum的(AC)₁₃、(AG)₁₃、(ACG)₆、(ACC)₈、(ACC)₈和(AAT)₁₂的SSR富集文庫。用RsaI和BstUI限制酶消化基因組DNA，片段連接到superSNX后與3端標(biāo)記生物素并結(jié)合在磁珠上的寡核苷酸微衛(wèi)星雜交，回收陽性片段，用SuperSNX24上游引物擴增，回收純化片段再雜交，二次富集的PCR產(chǎn)物克隆到TOPOTA載體上，陽性重組克隆用M13的上下游引物擴增，500～1 000 bp的片段用M13的上游引物測序，搜索基元重復(fù)數(shù)多于6個的SSRs，用M13的下游引物反向測序，用經(jīng)拼接好的序列設(shè)計引物，擴增14～30個P.ramorum菌株，獲得多態(tài)性SSR標(biāo)記。

1．3基于ISSR-PCR的方法分離SSR

Zietkiewicz等發(fā)明了ISSR(簡單序列重復(fù)間隔區(qū))分子標(biāo)記。用ISSR引物對全基因組DNA擴增，克隆測序后一般可以得到SSR序列一端的引物，即正向引物，采用染色體步行法進(jìn)行第2次克隆測序設(shè)計引物，從而獲得反向引物。ISSR-PCR分離SSR方法避免了文庫的構(gòu)建與篩選，有更強的目的性，大大縮短了時間，降低了研究費用，目前在植物病原菌中也有一定的應(yīng)用。如Steimel等利用ISSR-PCR技術(shù)分離Cera-tocystis fimbiata中的SSR位點。他們用純化的基因組DNA建立染色體步行文庫，設(shè)計5端錨定3～4個核苷酸的簡并SSR引物DBV(CAT)₈、DBH(CAG)₈、BBH(AAG)₈和BDB(GACA)。加接頭引物AP1擴增文庫，再將擴增產(chǎn)物連接T-載體克隆，提取重組質(zhì)粒，限制酶酶切后電泳，篩選含有預(yù)期片段的質(zhì)粒，測序陽性克隆，對合適的重復(fù)序列片段根據(jù)其3側(cè)翼序列設(shè)計兩個反向步移引物進(jìn)行擴增，得到上游片段，測序后再設(shè)計1個上游引物，擴增SSR片段，通過該方法共篩選出10個SSR位點。

1．4利用FIASCO方法分離SSR標(biāo)記

Zane于2002年提出了結(jié)合AFLP技術(shù)的SSR序列分離策略，即FIASCO法(利用AFLP快速分離重復(fù)序列)。該方法與選擇性雜交相似，但步驟簡單，成本低、效率高，步驟包括酶切基因組DNA，加上AFLP接頭，特異性引物進(jìn)行第1次PCR擴增，用生物素標(biāo)記的探針與擴增產(chǎn)物雜交，經(jīng)3次非

嚴(yán)謹(jǐn)性和3次嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫去除非特異性雜交，變性分離DNA片段進(jìn)行第2次擴增，PCR產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化克隆測序。該方法在植物病原菌中也開始得到應(yīng)用，如Hunter等用該方法開發(fā)Mycosphaerelanubilosa的SSR標(biāo)記，其具體步驟為先用Mse I消化M.nubilosa基因組DNA，加AFLP接頭進(jìn)行PCR擴增，將擴增片段與(ATCC)₅、(GATA)₆、(AG)₁₀(GT)₁₇、(TC)₁₅和(CA)₁₅探針雜交，磁珠富集目的片段，連接T-載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再擴增陽性菌落，選擇100～500 bp的片段，純化后直接測序以確定SSR的存在，試驗共測定了126個克隆，其中15個含有SSR片段。Nakabonge等也用該方法分離了Cryphonectria eucalypti中的SSR標(biāo)記。

1．5利用DNA序列信息開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記

雖然植物病原菌基因組研究起步較晚，但發(fā)展很快。目前，GenBank中已包含了數(shù)十種不同類型植物病原菌的EST序列或其他不同類型的DNA序列。除大量的植物病毒外，已有近40種植物病原細(xì)菌、15種植物病原菌真菌和3種疫霉菌全基因組測序已經(jīng)完成或正在進(jìn)行(http://cpgr.tigr.org)。一些原核生物全基因組序列中非冗余sSR數(shù)據(jù)庫也已建立。因此，從DNA序列中特別是從EST中發(fā)掘SSR已經(jīng)成為開發(fā)SSR標(biāo)記快速、廉價、有效的途徑。

最近，筆者對GenBank中28，197條Phytoph-thora sojae EST進(jìn)行了SSR分析，在1 322條EST中發(fā)現(xiàn)1 408個SSR，選擇243個SSR位點設(shè)計引物，用10個菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，有193對引物(79.4％)能有效擴增，其中93對引物在10個大豆疫霉菌分離物間擴增出多態(tài)性。Feau等從Septoria musiva的117條非冗余EST序列中開發(fā)了5個多態(tài)性ssR標(biāo)記。Lees等通過搜索EST和BAC序列尋找P.in festans的SSR標(biāo)記，獲得11個多態(tài)性SSR標(biāo)記。

Grunwald等對兩個測序完成的疫霉菌P.sojae(95 Mb)和P.ramorum(65 Mb)全基因組序列中2～6 bp重復(fù)的SSR進(jìn)行了分析，在這兩個菌的全基因組序列中分別發(fā)現(xiàn)了2 128個和1 000個SSRs。在P.ramorum全基因組序列中，Ivors等選出102個位點設(shè)計引物并用8個菌株進(jìn)行檢測，有62個(60.8％)能有效擴增，其中32個(51.6％)具有多態(tài)性；在P.sojae全基因組序列中，筆者選擇了260個SSR位點設(shè)計引物，用4株P(guān).sojae檢測，發(fā)現(xiàn)有208對(80％)引物能有效擴增，115對(55.3％)在4個菌株之間顯示多態(tài)性。

1．6用親緣關(guān)系相近物種的SSR標(biāo)記

SSR側(cè)翼序列具有保守性，有些物種的一些SSR引物能夠在其近緣種、屬中有效擴增。SSR標(biāo)記在物種間的通用性取決于SSR側(cè)翼序列的保守程度和SSR進(jìn)化的穩(wěn)定性。一些研究表明，基因組SSR標(biāo)記的通用性一般較差，而EST-SSR標(biāo)記的通用性較高。在植物病原菌中，一些種的SSR引物已證明能夠在其近緣種中擴增(表1)。但為了獲得一個新物種的?；許SR標(biāo)記，用近緣種SSR引物擴增獲得的產(chǎn)物需要測序和重新設(shè)計引物。Lefrancois等用Armillaria ostoyae的SSR引物擴增A.gallica基因組DNA，克隆、測序擴增片段，獲得6個含有SSR基元的片段，在這6個SSRs中，1個A.ostoyae引物直接用于A.gallica的擴增，其他5個需要重新設(shè)計引物以提高在A.ostoyae中的擴增效果。

此外，還有兩種基于RAPD富集SSR的開發(fā)策略被發(fā)展，一種是將RAPD隨機擴增條帶與帶有標(biāo)記的微衛(wèi)星探針雜交的RAHM(random amplifiedhybridization microsatellite)，一種利用重復(fù)錨定隨機引物抑或?qū)APD產(chǎn)物經(jīng)克隆再用特異性的ssR探針及載體引物篩選陽性克隆的PIMA(PcRisolation of microsatellite arrays)，但這兩種方法在植物病原菌中的應(yīng)用目前沒有報道。

2 SSR標(biāo)記在植物病原菌中的應(yīng)用

2．1植物病原菌種群變異及進(jìn)化研究

由于SSR標(biāo)記為共顯性，多態(tài)性高，特別是SSR位點具有分類學(xué)?；?，能夠用于也許含有非目標(biāo)微生物DNA的樣品，因此，SSR是研究植物病原菌遺傳變異與進(jìn)化最理想的分子標(biāo)記。

沈瑛等用7個SSR標(biāo)記對Magnaporthegrisea的遺傳多樣性進(jìn)行分析，獲得了一些有用的信息。如對來自湖南煙溪稻瘟病病圃連續(xù)4年分離的105個稻瘟病菌分離物分析表明，同一病圃內(nèi)稻瘟病菌存在豐富的遺傳變異，但親緣關(guān)系明確，105個分離物可劃分為6個不同的系譜群，其中一一些系譜群在年度之間也存在遺傳多樣性；而對不同地理來源的稻瘟病菌分析表明，稻瘟病菌遺傳多樣性豐富而且親緣關(guān)系復(fù)雜，研究的國外菌株具有與國內(nèi)菌株相同的遺傳背景和親緣關(guān)系，國內(nèi)菌株多樣性不存在地理上的差異。Ivors等用SSR標(biāo)記對P.ramorum的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn)來自苗圃的病原菌遺傳多樣性顯著高于森林中病原菌的遺傳多樣性，美國森林中只存在兩個密切相關(guān)的基因型，而歐洲苗圃的病原菌群體遺傳結(jié)構(gòu)中等復(fù)雜，包括多個密切相關(guān)的基因型，多位點分析表明美國森林中的種群為無性繁殖，可能是某個單一引入個體的后代。Enjalbert等根據(jù)ssR標(biāo)記和毒力分析結(jié)果將法國Puccinia striiformis f.sp.tritici種種群劃分為南、北兩個亞種群，其中北部種群屬于西北歐種群，而南部種群最有可能與地中海種群相關(guān)，這兩個亞種群來源于很早以前的兩個分化的無性系譜。

此外，SSR標(biāo)記也用于Dialodia pinea(=Sphaeropsis sapinea)、P.infestans、Sclerotin-ia sclerotiorum、Venturia inaequalis等植物病原菌的遺傳多樣性、遺傳分化和進(jìn)化研究。

2．2遺傳圖譜的構(gòu)建及無毒基因定位

目前，SSR標(biāo)記已應(yīng)用于M.grisea遺傳圖譜的構(gòu)建和無毒基因定位。Kaye等首先將23個SSR標(biāo)記整合到M.grisea的遺傳圖譜上，這些標(biāo)記在M.grisea的7條染色體上都有分布，有的定位在缺少標(biāo)記的區(qū)域。王艷麗等利用M.grisea菌株CH63和TH16雜交組合構(gòu)建了包含100多個SSR

位點、覆蓋7條染色體的遺傳圖譜并對6個無毒基因進(jìn)行了初步定位。Kaye等將134個SSR標(biāo)記填充到M.grisea的遺傳圖譜上，標(biāo)記分布在6條染色體上，平均遺傳距離為1 cm。最近，Ma等也利用ssR標(biāo)記鑒定和精細(xì)作圖了一個新的M.grisea無毒基因AvrPi15，SSR標(biāo)記將該基因定位在M.grisea第6染色體上，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步獲得了2個與該基因共分離的候選無毒基因標(biāo)記，為該基因克隆奠定了基礎(chǔ)。

2．3用于病害流行學(xué)的研究

Gobbin等研究了Plasmopara viticola的二次侵染在霜霉病流行中的重要作用。用4個SSR標(biāo)記分析了來自18個地方的4 685個病樣，結(jié)果顯示70％的基因型只出現(xiàn)1次，14％的基因型出現(xiàn)2次，只有7個基因型出現(xiàn)了50次以上，這說明P.viticola在流行中有許多基因類型，流行是多種基因型綜合作用的結(jié)果，每一種在侵染中只有很小的作用，這種結(jié)論與前人結(jié)論向背，即孢子囊可以遠(yuǎn)距離傳播，單種基因型造成流行。群體遺傳學(xué)的研究可以為植物病害空間、時間的流行動態(tài)研究提供依據(jù)，分子標(biāo)記又為遺傳學(xué)的研究提供了便利的工具，特別是方便有效的分子標(biāo)記。

2．4用于病原菌鑒定及交配型、種內(nèi)型的區(qū)分

SSR標(biāo)記也是一種鑒定植物病原菌的種、菌株類型、菌株交配型、形態(tài)型及不同病原譜系的理想分子標(biāo)記。Ivors等用12對SSR引物對分別來自美國和歐洲的大量P.ramorum、2株P(guān).alateralis和2株P(guān).hibernalis進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有1對引物在P.alateralis和P.hibernalis有擴增，且片段長度與P.ramorum中不同，認(rèn)為SSR標(biāo)記可用于P.ramorum的鑒定。Prospero等用P.ramorum基因組的ssR標(biāo)記分析該菌兩種交配型(A1、A2)，發(fā)現(xiàn)22個ssR位點中有7個在兩個交配型中出現(xiàn)多態(tài)性，可以用于交配型的鑒定。Burgess等利用11個多態(tài)性sSR標(biāo)記檢測了40個代表不同形態(tài)型的Sphaeropsis sa pinea的分離物和與其密切相關(guān)的近緣種Botryos phaerisa obtuse的2個分離物，結(jié)果表明ssR標(biāo)記能夠清楚區(qū)分S.sapinea不同的形態(tài)型，并發(fā)現(xiàn)Ⅰ型分離物與B.obtuse相同，C型與A型的遺傳關(guān)系比C型與B型的近，B型遺傳多樣性最豐富，其分離物能夠根據(jù)不同的地理起源進(jìn)一步被區(qū)分。Barnes等用ll對SSR引物分析了來自10個不同國家的20個C.fimbriata分離物，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記可以明顯地區(qū)分不同地理和不同寄主來源的?；苑N群。對Phialo phora gregata的研究表明，SSR標(biāo)記能夠區(qū)分其種內(nèi)的2個基因型。

3展望

SSR標(biāo)記雖然在植物病原菌中發(fā)展才剛剛起步，其應(yīng)用也僅局限在少數(shù)植物病原菌，但已凸顯出其強大的優(yōu)越性。相對于其他標(biāo)記，SSR標(biāo)記共顯性，多態(tài)性高，特別是具有分類學(xué)?；缘忍攸c，是植物病原菌的種類鑒定、無毒基因鑒定與作圖、起源與進(jìn)化、傳播與流行研究等最理想的分子標(biāo)記。隨著簡單、有效和廉價的SSR標(biāo)記分離技術(shù)不斷發(fā)展，特別是植物病原菌基因組學(xué)的發(fā)展和大量DNA序列數(shù)據(jù)開發(fā)，SSR標(biāo)記將會廣泛應(yīng)用在植物病原菌研究的各個方面。