白芷黑斑病病原菌鑒定及病害發(fā)生規(guī)律研究

喻　霜　葉華智　嚴吉明

摘要對四川白芷黑斑病的癥狀、病原菌致病性和形態(tài)特征等進行了研究，確定病原菌為當歸葉點霉(Phyllostictaangelicae Saccardo)。經(jīng)兩年的田間病害發(fā)生動態(tài)調(diào)查，該病在四川始發(fā)期為3月上旬，高峰期為6月份，病株率達100％，病葉率達74.51％。病害的初侵染源主要是留種株的病葉和田間病殘體。病菌分生孢子借雨滴飛濺的方式傳播，并在白芷生長期中不斷引起再侵染。

關(guān)鍵詞白芷；白芷黑斑??；當歸葉點霉；發(fā)生規(guī)律

中圖分類號S 435.672

白芷(Angelica dahurica)為我國傳統(tǒng)中藥材，屬傘形科當歸屬多年生草本植物，以根入藥，同時也是一種香料和調(diào)味輔料。川白芷為川產(chǎn)地道藥材，主產(chǎn)于四川遂寧，其產(chǎn)量約占全國商品白芷總產(chǎn)量的70％。近年來，在四川遂寧等白芷種植區(qū)普遍發(fā)生了一種新病害——白芷黑斑病，該病蔓延迅速，病情嚴重，導致葉片枯死，植株早衰，已經(jīng)成為產(chǎn)區(qū)白芷的主要病害之一。迄今未見有白芷黑斑病的研究和報道。為了明確引起該病的病原、掌握病害田間發(fā)生發(fā)展規(guī)律，筆者對白芷黑斑病進行了病原菌的分離鑒定和致病性測定，同時于2006—2007年連續(xù)兩年調(diào)查了該病的田間發(fā)生動態(tài)和病害循環(huán)。

1材料與方法

1．1病原菌的分離與鑒定

1．1．1癥狀觀察

在四川省遂寧市白芷生產(chǎn)基地采集病害樣本進行觀察，紀錄病害癥狀。

1．1．2病原菌的分離和致病性測定

采集有黑斑病癥狀的白芷病葉，按常規(guī)組織分離后再經(jīng)單孢純化培養(yǎng)，獲得菌株。用無菌水配制孢子懸浮液，對白芷健株進行噴霧接種，塑料袋保濕48 h，發(fā)病后觀察癥狀特征并再次分離鑒定病原菌，完成柯赫氏法則檢驗。

1．1．3病原菌的種類鑒定

分別對病斑上的病原菌子實體和致病性測定的分離菌的培養(yǎng)性狀、分生孢子器及分生孢子的形態(tài)大小進行測定，并按照真菌分類標準進行種類鑒定。

1．2病害發(fā)生規(guī)律研究

1．2．1病害田間發(fā)生動態(tài)調(diào)查

白芷是跨年收獲的藥材，在當年9月中旬至10月上旬播種，次年的7月底至8月中旬收獲。田間病害發(fā)生動態(tài)的調(diào)查時間為2006年2～7月和2006年11月至2007年6月兩個白芷生長季，調(diào)查地點在四川遂寧白芷生產(chǎn)基地。選取2處田塊作為定點調(diào)查地，采用五點法，取對角線上的5點，定點定株調(diào)查，每隔15天左右調(diào)查1次病害的發(fā)病率及嚴重度(按5級分級標準)，并計算病情指數(shù)。此外，還在田間大范圍觀察白芷黑斑病的發(fā)病情況。病葉嚴重度分級標準如下。

0級：整葉無病斑；

1級：病斑面積占全葉面積＜1/4；

2級：病斑面積占全葉面積的1/4～1/2；

3級：病斑面積占全葉面積的1/2～3/4；

4級：病斑面積占全葉面積＞3/4。

1．2．2病原菌存活力的測定

2006年7月從田間采集病葉，風干后保存于室內(nèi)。定期剪取病斑，置于無菌水中使分生孢子器內(nèi)的分生孢子釋放出制成孢子懸液，采用玻片萌發(fā)法，在20℃下，48 h后觀察分生孢子萌發(fā)情況，計算孢子的存活率；同時取病斑病健交界處，用常規(guī)組織分離法進行分離，測定菌絲體在病組織內(nèi)的存活時間，為了解病菌的越冬越夏提供一定依據(jù)。

1．2．3留種株上病原菌越冬越夏的調(diào)查

白芷采用種子繁殖，一般在7月挖收白芷時選取植株栽植，次年6～7月開花結(jié)實收取種子。因此留種株上是否有黑斑病發(fā)生，是掌握病菌越冬越夏場所的重要方面，為此，對留種株上的黑斑病發(fā)生情況進行了田間調(diào)查觀察。

2結(jié)果與分析

2．1病害癥狀

白芷黑斑病主要危害葉片，亦可危害葉柄和莖(圖1)。葉部發(fā)病初期呈現(xiàn)水浸狀小斑點，逐漸擴展為近圓形或不規(guī)則形的暗褐色病斑，直徑3～15 mm，后期病斑中部顏色變淺，邊緣仍保持暗褐色；病斑表面散生小黑點(分生孢子器)，病健交界處有時會出現(xiàn)褪綠黃色圈。植株成葉發(fā)病較重，幼嫩新葉發(fā)病較輕。葉柄和莖上的病斑為長條形暗褐色，稍凹陷。

2．2柯赫氏法則驗證

用分生孢子懸浮液噴霧接種白芷葉片，6～8 d后出現(xiàn)水浸狀小點，15 d左右形成暗褐色典型病斑，與田間自然發(fā)病癥狀相似。對病菌進行組織分離，獲得了相同病原菌，證明該菌是白芷黑斑病的致病菌。

2．3病原菌種類鑒定

病原菌的分生孢子器葉面生，多為散生，球形、扁球形，直徑70～135 μm，器壁褐色至暗褐色，初埋生后突破表皮，孔口外露，圓形，周圍細胞顏色較深。分生孢子單胞，無色，橢圓形，具有1個油球，大小(3.3～5.0)μm×(1.7～2.2)μm，有黏液，孢子不易分散(圖2)。葉片上的分生孢子器遇水或有露滴時釋放出分生孢子，有時在孔口聚集成淡黃色黏質(zhì)團。

在PDA培養(yǎng)基上，病菌菌落圓形平鋪，短絨狀，初為灰白色，后期轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?；菌絲無色或淡褐色，有分隔；分生孢子器初為黃褐色，成熟后為黑色小點，當濕度很高時從孔口中溢出分生孢子，聚集形成奶油色的分生孢子團；分生孢子器直徑為65～130μm，分生孢子大小為(2.8～4.5)μm×(1.8～2.0)μm，兩者在形態(tài)和大小方面都與植物組織上觀察到的相近。

參照有關(guān)資料，確定川白芷黑斑病的病原菌為半知菌亞門葉點霉屬的當歸葉點霉(Phyllos—ticta angelicae Saccardo)。

2．4病害田間發(fā)生動態(tài)研究

白芷黑斑病在田間的一般發(fā)生發(fā)展情況是：田間最早出現(xiàn)的病株多在白芷留種田附近以及連作地內(nèi)；病害最早發(fā)生在植株下部葉片，逐漸向植株上部葉片及鄰近植株擴展，發(fā)病初期有明顯的中心病團。

2006—2007年對白芷黑斑病兩個生長季的田間發(fā)生動態(tài)調(diào)查結(jié)果見圖3、4：在白芷秋播的幼苗上未發(fā)現(xiàn)黑斑??；病害始發(fā)期2006年為4月15日、2007年為4月1日，其病株率、病葉率分別為10.50％、3.52％和12.50％、5.85％。2006年4月底至5月中旬病害發(fā)展迅速，5月15日病株率和病葉率達88.50％和41.32％；2007年春為暖春，病害的發(fā)生和發(fā)展較2006年同期更早更快，在4月期間病情急劇發(fā)展，5月1日病株率、病葉率分別升至80.00％和39.15％。2006年病害高峰期為6月15日，病葉率達66.05％，到7月1日病情指數(shù)為35.25；2007年6月1日病害進入高峰期，病葉率升至最高74.51％，6月20日病株率高達100％，病情指數(shù)為37.04。至此，白芷進入了生育后期，葉片普遍出現(xiàn)生理性變黃枯萎，病情發(fā)展基本停止。

通過田間大范圍的發(fā)病觀察，該病始發(fā)期2006年為3月13日、2007年為3月1日，病害的消長情

況與定點調(diào)查結(jié)果基本一致。

2．5病原菌存活力的測定

2．5．1分生孢子存活力測定

對病葉上病菌分生孢子的萌發(fā)率測定結(jié)果表明(圖5)：從2006年7月采回病葉到11月1日，分生孢子的萌發(fā)率為80.33％。以后隨時間延長，孢子萌發(fā)率逐漸下降，到2007年4月15日，孢子的萌發(fā)率仍有4.21％。

2．5．2病葉中菌絲體的存活測定

用組織分離法，自120 d起不能再從病葉標本里分離出病原菌，說明菌絲體在室溫下在病組織內(nèi)的存活時間約為4個月。

2．6田間留種株上的病害觀察

7月下旬至8月中旬生產(chǎn)上栽植留種株，8月下旬留種株葉片上見有黑斑病發(fā)生，并在其上緩慢擴展；11月份進入冬季，病害基本停止發(fā)展；直至次年的春季氣溫回升后，病害又繼續(xù)在留種株上蔓延。

2．7不同白芷品種上的發(fā)病情況

2007年在田間病害基本穩(wěn)定時(6月中旬)，在遂寧白芷生產(chǎn)基地品比試驗田中對不同品種白芷上黑斑病的發(fā)生情況進行了調(diào)查，結(jié)果說明在發(fā)病的嚴重程度上各品種之間存在一定差異(表1)。

3結(jié)論與討論

白芷黑斑病為四川白芷上的一種新病害，雖然近年在種植區(qū)發(fā)生嚴重，但至今尚未見有對該病害的研究報道。病原菌的鑒定是研究病害的一個重要基礎性環(huán)節(jié)。文獻中僅有于莉等1994年在東北興安白芷葉片上發(fā)現(xiàn)了一種葉點霉寄生菌一當歸葉點霉(Phyllosticta angelicae Saccardo)；此后陳小紅等報道四川白芷的黑斑病病原菌為Phyllostic-ta sp.。筆者在此基礎上對四川白芷上的黑斑病進行了較系統(tǒng)的研究，確定引起川白芷黑斑病的病原菌為半知菌亞門葉點霉屬的當歸葉點霉。

研究病害的田間發(fā)生動態(tài)，對了解病害的發(fā)生規(guī)律和防治有重要的理論和實踐意義。四川遂寧屬亞熱帶濕潤季風氣候，全年氣溫溫和，降雨充沛，日照充足，適宜白芷黑斑病的發(fā)生和發(fā)展。隨著近幾年種植面積的擴大和集約化栽培，該病在當?shù)匚：χ鹉昙又?。綜合2006—2007年對白芷黑斑病田間發(fā)生動態(tài)的研究，結(jié)論是：該病始發(fā)期為3月上旬；4月至5月上旬主要向周圍植株水平擴展，病株率增長較快；5月中旬至6月中旬主要向植株上部葉片垂直擴展，病情指數(shù)明顯升高，高峰期為6月份。由于黑斑病菌的分生孢子在分生孢子器內(nèi)，當高濕或遇水露時才釋放出分生孢子，因此病菌主要靠雨滴飛濺的方式傳播；加上病菌產(chǎn)孢量大、致病性強，在生長季不斷引起再侵染，白芷葉片大而平展、密集，皆易于該病害的傳播和流行。

對病原菌分生孢子和病組織中菌絲體存活力的測定，以及田間留種株上黑斑病的發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果表明：病原菌主要以菌絲體和分生孢子器在田間病殘體和留種株上越夏越冬，以分生孢子作為初侵染來源。因此做好秋季田間病殘體的清理，并及時摘除留種株上的病葉和藥劑防治，可有效減少病害初侵染源。