馬爾尼菲青霉菌藥靶基因發(fā)掘與利用

摘要：隨著免疫抑制劑、深度化療、廣譜抗生素等的廣泛應(yīng)用，真菌感染尤其是條件致病真菌感染在艾滋病、惡性腫瘤等病人中發(fā)病率日趨升高，成為艾滋病、惡性腫瘤等患者的主要致死因素。其中馬爾尼菲青霉菌感染已被公認(rèn)是艾滋病指征之一。本文論述了馬爾尼菲青霉菌藥靶基因發(fā)掘與利用。

關(guān)鍵詞：真菌；馬爾尼菲

在泰國(guó)，70%－80%的艾滋病患者感染上馬尼菲青霉病，是繼結(jié)核病和隱球酵母病之后的第三大并發(fā)??；在香港，10%的愛滋病病人感染上馬尼菲青霉?。辉谥袊?guó)大陸，馬尼菲青霉病多發(fā)生于廣西、廣東、云南、貴州等地。然而，由于對(duì)馬尼菲青霉病及其病原菌認(rèn)識(shí)不夠，經(jīng)常造成誤診、誤治，死亡率很高。

由于病原真菌屬于真核類生物，開發(fā)高效、廣譜的抗真菌藥物一直是舉世公認(rèn)的難題。目前，臨床上僅有氟康唑、伊曲康唑和兩性霉素B等有限的幾種抗真菌藥物；而且現(xiàn)有抗真菌藥物存在明顯的缺點(diǎn)：作用慢、抗菌譜窄、毒性一般都比較大。另外耐藥菌株的出現(xiàn)（如：馬爾尼菲青霉菌對(duì)臨床上廣泛使用的氟康唑具有耐藥性），限制了僅有的幾個(gè)抗真菌藥物的使用。但抗真菌藥物的市場(chǎng)潛力巨大，據(jù)預(yù)測(cè)到2007年抗真菌藥物市場(chǎng)份額將達(dá)到87億美元（http://www.bccresearch.com），抗真菌藥物的研究仍是目前藥物研發(fā)方面的一個(gè)熱點(diǎn)。

此外，抗真菌藥物不僅具有很大的市場(chǎng)潛力，也是發(fā)展新的抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等的一個(gè)有效途徑。如臨床上廣泛使用的免疫抑制劑（環(huán)孢霉素A、他克莫司、雷酚酸、雷帕霉素等）最初都是作為抗真菌活性藥物來開發(fā)的。目前最具開發(fā)前景的新一代抗腫瘤藥物埃博霉素是由粘細(xì)菌產(chǎn)生的一新型天然細(xì)胞毒化合物，通過誘導(dǎo)微管蛋白多聚體形成超穩(wěn)定態(tài)，阻礙有絲分裂，具有抗真菌和抗腫瘤活性。因此，通過對(duì)主要引起我國(guó)和東南亞地區(qū)發(fā)病的馬爾尼菲青霉菌，篩選特異的診斷標(biāo)記物、藥物靶標(biāo)，展開基因功能研究，不僅為解決臨床診斷和預(yù)防奠定基礎(chǔ)，而且也為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供一個(gè)新的思路。

馬爾尼菲青霉菌是一種溫度調(diào)控的二型性真菌，在25°C和37°C下分別為絲狀體型和酵母型。我們知道人的體溫為37°C，馬爾尼菲青霉菌感染人后為酵母型。因此，研究宿主（這里特指人）對(duì)病原菌馬爾尼菲青霉菌的形態(tài)調(diào)控，揭示馬爾尼菲青霉菌二型性變化的機(jī)制，將為獲得新的藥物靶標(biāo)基因，并進(jìn)行抗真菌藥物的篩選，為全面而深入地研究馬爾尼菲青霉菌分子遺傳和免疫基礎(chǔ)提供契機(jī)，也為選擇侯選疫苗抗原和藥物靶標(biāo)奠定理論基礎(chǔ)。

在國(guó)際上首次針對(duì)馬爾尼菲青霉菌進(jìn)行了大規(guī)模的基因表達(dá)譜研究。通過對(duì)馬爾尼菲青霉菌菌絲態(tài)、酵母態(tài)和萌發(fā)孢子三種狀態(tài)進(jìn)行大規(guī)模cDNA測(cè)序，獲得23000條基因表達(dá)序列，組裝后獲得了11367個(gè)基因（與估計(jì)馬爾尼菲青霉菌基因組基因數(shù)一致），其中2185個(gè)基因具有完整的起始和終止密碼子。同時(shí)利用SAGE技術(shù)對(duì)馬爾尼菲青霉菌菌絲態(tài)、酵母態(tài)等狀態(tài)進(jìn)行了基因表達(dá)譜研究，初步揭示了馬爾尼菲青霉菌形態(tài)轉(zhuǎn)換中基因表達(dá)的特征。在國(guó)際上首次針對(duì)馬爾尼菲青霉菌進(jìn)行大規(guī)模突變體庫(kù)研究。利用T-DNA介導(dǎo)進(jìn)行大規(guī)模馬爾尼菲青霉菌插入突變體技術(shù)，獲得了20000多個(gè)突變體，從中篩選獲得了近3000個(gè)具有明顯表型變化的突變體（包括生長(zhǎng)緩慢型2600個(gè)、兩相差異23個(gè)、菌落形態(tài)變化15個(gè)和凋亡相關(guān)2個(gè)），并通過tail-PCR技術(shù)鑒定了1000個(gè)突變體的側(cè)翼序列，其中約1/3位于基因編碼區(qū)，2/3可能位于調(diào)控區(qū)。同時(shí)，結(jié)合其他真菌種類尤其是莢膜組織孢漿菌和白色念珠菌基因組信息，采用比較基因組和計(jì)算生物學(xué)等方法研究和評(píng)價(jià)信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和調(diào)控等通路上的關(guān)鍵基因?qū)︸R爾尼菲青霉菌二型性變化的影響。著重圍繞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和調(diào)控等通路上的關(guān)鍵功能基因，篩選出一批具有新穎表型的功能基因。為在大規(guī)模功能基因篩選的基礎(chǔ)上對(duì)重要基因進(jìn)行深層次的研究奠定了基礎(chǔ)。

在上述工作的基礎(chǔ)上，利用我們針對(duì)真菌所建立的RNAi干擾技術(shù)，并結(jié)合定量PCR和蛋白質(zhì)表達(dá)研究等技術(shù)對(duì)rpfA和DRK1兩個(gè)信號(hào)調(diào)控基因展開研究。通過研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因?qū)︸R爾尼菲青霉菌青霉菌的形態(tài)、生長(zhǎng)、產(chǎn)孢等生理過程具有明顯的調(diào)控作用。特別值得指出的是DRK1基因?qū)︸R爾尼菲青霉菌的生長(zhǎng)、形態(tài)、發(fā)育、細(xì)胞壁、細(xì)胞核等都具有明顯的調(diào)控作用，是我們所發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有全局調(diào)控作用的基因，提示該基因是一個(gè)可能的藥物靶標(biāo)。通過化合物虛擬篩選和活性篩選，獲得了一系列個(gè)具有抗真菌活性的化合物并申請(qǐng)了專利，其中3個(gè)已經(jīng)獲得授權(quán)。

作者簡(jiǎn)介：任雙喜，國(guó)家人類基因組南方研究中心副研究員，歷任生物信息學(xué)部負(fù)責(zé)人，主任助理等職，享受國(guó)務(wù)院政府特殊津貼。。主要研究方向?yàn)榛蚪M和生物信息學(xué)。他承擔(dān)了國(guó)家和地方的多項(xiàng)重大科研計(jì)劃如國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（973 計(jì)劃）、國(guó)家863 計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家863計(jì)劃重大專項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目、上海市科技攻關(guān)重大項(xiàng)目和中法先進(jìn)合作項(xiàng)目等。此外，還參與了人類基因組1％測(cè)序計(jì)劃和腎上腺-垂體-下丘腦軸、肝癌及癌旁組織全長(zhǎng)基因的克隆和生物信息學(xué)分析工作以及人類全長(zhǎng)基因功能注釋的國(guó)際合作。在過去的幾年里，他帶領(lǐng)課題組在相關(guān)領(lǐng)域取得了突出的成績(jī)，獲得了一系列創(chuàng)造性的科技成果，在《自然》、《科學(xué)》等世界頂級(jí)權(quán)威雜志發(fā)表學(xué)術(shù)論文。同時(shí)，他非常重視科研成果的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)，獲得具有發(fā)展新的診斷手段和疫苗開發(fā)潛力的基因2個(gè)，獲得抗病原微生物活性化合物20多個(gè)，已經(jīng)獲得專利3項(xiàng)。曾獲教育部科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、上海市自然科學(xué)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)、教育部科技成果完成者證書、中國(guó)醫(yī)藥科技十大新聞和第一屆“上海市科教黨委系統(tǒng)青年科技創(chuàng)新人才獎(jiǎng)”等。