睡眠剝奪對老齡大鼠學習記憶及磷酸化p38MAPK信號、Aβ表達的影響

趙雅寧 郭 霞 陳長香 陳桂芝 李淑杏 李建民 (河北聯(lián)合大學，河北 唐山 063000)

睡眠不足 (部分睡眠剝奪)是常態(tài)老年人常見現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)睡眠不足與老年人認知功能減退密切相關(guān)，可導致導致學習、記憶能力下降，反應遲鈍，注意力分散，定向障礙，出現(xiàn)幻覺等〔1〕;但其具體的神經(jīng)生物學機制尚未完全闡明。p38絲裂原蛋白激酶 (MAPK)是一真核細胞廣泛表達的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，活化后通過調(diào)控底物如炎癥因子，凋亡蛋白等表達，參與Alzheimer病認知障礙、血管性癡呆等疾病病理損傷過程〔2，3〕。β 淀粉樣肽 (Aβ)是前體蛋白 (APP)通過蛋白酶解途徑裂解成的長度為39～43個氨基酸的片段，是神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞正常代謝的產(chǎn)物。但如果Aβ表達增加，作用時間延長，則可在海馬、及新皮質(zhì)等部位沉淀、堆積，并對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用。本實驗通過觀察不同睡眠剝奪 (SD)時間對老齡大鼠海馬區(qū)磷酸化P38MAPK蛋白和Aβ表達的影響，并應用P38MAPK蛋白抑制劑SB203580進行干預，為進一步闡明SD損害認知功能的可能機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備 雄性SD老齡大鼠90只〔北京維通利華公司，合格證:SCXK(京)2002-003〕，12～14月齡，體質(zhì)量(330±20)g，隨機分為對照組、模型組、SB203580干預組，每組又隨機平均分為SD1 d、3 d、5 d 3個亞組。采用改良多平臺法制備快速動眼SD模型。睡眠剝奪箱大小30 cm×30 cm×150 cm，其中央放置一徑為6 cm，高8 cm的平臺。剝奪箱內(nèi)注有水，水面低于平臺2 cm，水溫保在(20±2)℃。大鼠可以在平臺上自由攝取食物和水，但當進入睡眠時骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，造成 SD。對照組除平臺增大為直徑13 cm，其余因素與SD組一致，大鼠在大平臺上可以部分活動，并可以進入睡眠。

1.2 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察(HE染色) 各組動物在規(guī)定時間點以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)，用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦，后固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。切片二經(jīng)甲苯脫蠟，梯度乙醇降至水，HE染色。每只鼠連續(xù)3張冠狀背側(cè)海馬切片，采用圖像分析儀(美國Bio-Rad公司)計數(shù)正常神經(jīng)元，取均值。

1.3 磷酸化P38MAPK和Aβ免疫組化 切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復，分別滴加磷酸化P38MAPK抗體(1∶200)、Aβ抗體(1∶150)，濕盒中4℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV二步法)，37℃溫箱30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析:每個標本取5張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬隨機選取4個視野，用計算機圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)對各組陽性細胞進行吸光度(absorbance，A)分析。

1.4 免疫印跡法測定磷酸化P38MAPK和Aβ 大鼠致死后，迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織，稱量0.6 g，4℃PBS充分洗滌，加入3倍體積的4℃全細胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5 min，12 000 r/min，取上清?？捡R斯亮藍法測各樣本的蛋白含量，樣本貯存于－80℃?zhèn)溆谩z測步驟:蛋白樣品40 μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10 min，100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫下震蕩2～3 h，加入抗體(磷酸化 P38MAPK，1∶2 000;Aβ，1∶1 500)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，標記的二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，用圖像分析儀測定光密度，作定量分析。

1.5 學習和記憶功能檢測 按照 Smith等〔4〕的方法，采用Morris水迷宮進行檢測，上午、下午各一次，記錄各組老齡大鼠搜索安全島(即平臺)潛伏期時間(單位時間:s);和撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數(shù)，取檢測記錄的總均值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以±s表示，進行方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 對照組海馬神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊致密，可見少數(shù)變性壞死的神經(jīng)元;模型組中，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)在1 d即出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為細胞變性水中，隨時間延長至3 d、5 d，經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)損傷明顯，視野內(nèi)可見有死亡形態(tài)改變的神經(jīng)細胞，表現(xiàn)為細胞周圍空隙增寬、胞核皺縮濃染等，存活神經(jīng)元密度明顯減少(P＜0.05);SB203580干預后形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷減輕，存活神經(jīng)元密度均增加(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2 磷酸化P38MAPK和Aβ免疫組化結(jié)果 磷酸化p38MAPK陽性表達主要位于細胞核，少量表達在細胞漿;Aβ陽性表達主要位于細胞質(zhì)。陽性細胞的胞質(zhì)可見細小的棕黃色顆粒。對照組大鼠海馬區(qū)有少量磷酸化p38MAPK和Aβ的陽性細胞，染色較淡。SD后1 d、3 d、5 d，磷酸化P38MAPK和Aβ均呈不同程度地表達，二者陽性細胞主要分布在海馬敏感區(qū)CA1區(qū)、其次在CA2、CA3區(qū)，齒狀回也少量有分布。磷酸化p38MAPK陽性反應SD后1 d開始逐漸增強，5 d達高峰，此時顯色最深。Aβ在SD后1 d逐步增高，5 d達高峰，顯色最深。SB20358干預組中P38MAPK和Aβ陽性細胞數(shù)目和陽性反應灰度值減弱。見圖2、圖3，表2、表3。

表1 各組海馬區(qū)的神經(jīng)元密度比較(± s，n=10)

表1 各組海馬區(qū)的神經(jīng)元密度比較(± s，n=10)

1)與對照組比較，2)與模型組比較:P＜0.05，下表同

模型組 17.85±3.921) 15.65±3.181) 12.12±2.981)SB203580 20.63±3.461)2) 18.86±3.071)2) 17.63±3.281)2)

表2 海馬磷酸化p38MAPK蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

表2 海馬磷酸化p38MAPK蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

組別1 d 3 d 5 d對照組1.96±0.58 1.88±0.62 1.98±0.64模型組 4.28±1.251) 8.60±3.201) 12.68±4.591)SB203580組 2.98±1.002) 4.86±2.282) 8.48±3.682)

圖1 各組神經(jīng)元形態(tài)變化(箭頭示壞死神經(jīng)細胞)(HE，×200)

圖2 各組磷酸化p38MAPK的表達(DAB，×400)

圖3 各組Aβ養(yǎng)性神經(jīng)元(DAB，×400)

2.3 磷酸化P38MAPK和Aβ免疫印跡法分析結(jié)果 與對照組比較，模型組中磷酸化p38MAPK、Aβ蛋白水平在SD 1 d、3 d、5 d時間點表達上調(diào)。SB20358干預組中磷酸化p38MAPK、Aβ蛋白水平下降。見表4、表5。

表3 海馬Aβ蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

表3 海馬Aβ蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

組別1 d 3 d 5 d對照組1.40±0.37 1.52±0.55 1.48±0.52模型組 4.78±2.011) 7.98±3.291) 10.68±4.261)SB203580組 2.54±1.162) 4.16±2.082) 6.48±3.282)

2.4 學習記憶功能結(jié)果 與對照組比較，模型組老齡大鼠搜索安全島潛伏期為明顯延長、穿越原平臺位置的次數(shù)減少(P＜0.05);SB20358干預可縮短老齡大鼠搜索安全島潛伏期時間、增多穿越原平臺位置的次數(shù)(P＜0.05)，見表6。

表4 海馬磷酸化p38MAPK蛋白表達水平比較(± s，n=10)

表4 海馬磷酸化p38MAPK蛋白表達水平比較(± s，n=10)

?

表5 海馬Aβ蛋白表達水平比較(± s，n=10)

表5 海馬Aβ蛋白表達水平比較(± s，n=10)

?

表6 各組大鼠水迷宮檢測結(jié)果(± s，n=10)

表6 各組大鼠水迷宮檢測結(jié)果(± s，n=10)

組別 潛伏期(s)1 d 3 d 5 d穿越平臺次數(shù)(次)1 d 3 d 5 d對照組 65.5±8.5 64.7±6.8 65.8±8.5 9.20±1.52 9.25±1.62 9.31±1.58模型組 98.5±21.81) 115.6±24.51) 128.8±28.01) 6.48±1.111) 4.88±1.261) 2.28±1.101)SB203580組 78.0±18.71)2) 80.5±25.71)2) 96.8±24.81)2) 7.98±1.321)2) 6.68±1.121)2) 4.17± 1.151)2)

3 討論

本實驗采用“改良多平臺睡眠剝奪法”建立動物模型，對老齡大鼠進行不同時間的SD，結(jié)果顯示，與對照組比較，隨SD時間延長，模型組中老齡鼠搜索安全島潛伏期為明顯延長、穿越原平臺位置的次數(shù)減少，說明SD可降低老齡鼠學習記憶功能。

海馬是大腦的重要結(jié)構(gòu)，在學習和記憶功能以及調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)活動中起重要作用。研究顯示損毀雙側(cè)海馬可大大妨礙動物視覺分辨學習，使大鼠Y迷宮分辨學習和防御條件反應的保持遭到嚴重的破壞〔5〕。本實驗結(jié)果，隨睡眠剝奪時間延長，模型組動物海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在第3、5天可見明顯壞死細胞，說明睡眠剝奪可造成海馬結(jié)構(gòu)損傷。近期研究顯示在Alzheimer's病(AD)、老年性癡呆等認知功能障礙等病變中，均有海馬區(qū)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)發(fā)生紊亂〔2，3〕。MAPKs信號通路是連接大多數(shù)細胞外信號與膜受體、轉(zhuǎn)錄因子和各基因調(diào)節(jié)的中央信號通路，其家族成員包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK等。研究認為P38MAPK信號的活化對中樞神經(jīng)系的影響主要表現(xiàn)為負性調(diào)節(jié)作用，其活化后通過介導了許多炎性因子和致病因素，直接對海馬神經(jīng)突觸可塑性產(chǎn)生損傷，導致長時程增強(LTP)的損傷從而致空間學習能力受損〔6，7〕。胡亞卓等〔8〕發(fā)現(xiàn)多奈哌齊可改善血管癡呆模型動物的學習記憶成績，而這與抑制海馬區(qū)P38MAPK活化有關(guān)。本研究結(jié)果，隨SD時間延長，海馬區(qū)磷酸化p38MAPK明顯增高，給予SB2035806干預后，海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損害減輕、磷酸化p38MAPK表達下降、動物學習記憶得到改善，這說明P38MAPK信號活化參與了睡眠剝奪導致認知功能損傷的病理過程，并在該進程中具有關(guān)鍵作用。

Aβ來源于它的前體物質(zhì)淀粉樣前體蛋白APP通過β-分泌酶和γ-分泌酶剪切而產(chǎn)生〔9〕，具有神經(jīng)毒性，包括:介導氧化應激損傷、炎癥反應、損傷膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、誘導神經(jīng)細胞凋亡等。已有研究表明:APP和學習記憶密切相關(guān)，APP缺陷的小鼠出現(xiàn)年齡依賴性的認知功能的障礙，大腦神經(jīng)元突觸密度下降〔10〕。在AD的動物模型實驗中，Aβ疫苗可以抑制Aβ斑的形成，阻止認知能力的衰退〔11〕。本研究結(jié)果顯示，模型組中大鼠海馬區(qū)Aβ濃度明顯增加，提示SD導致認知功能損傷與Aβ有關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)SB2035806組海馬區(qū)Aβ表達減少，說明SD過程中，P38MAPK信號活化與Aβ產(chǎn)生有關(guān)。結(jié)合文獻〔12〕推測SD后活化的P38MAPK信號通過介導炎性因子IL-1β及TNF-α形成，促進Aβ的沉積，從而導致神經(jīng)細胞損傷，神經(jīng)功能缺失。SD后P38MAPK信號轉(zhuǎn)導與Aβ之間的確切機制尚需進一步研究。

1 劉小平，陳長香，李建民，等.改善睡眠質(zhì)量對老年人記憶功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(8):1119-20.

2 Lennmyr F，Karlsson S，Gerwins P，et al.Activation of mitogen-activated protein kinases in experimental cerebral ischemia〔J〕.Acta Neurol scand，2002，106(6):333-340.

3 Swatton JE，Sellers LA，F(xiàn)aull RL，et al.Increased MAP kinase activity in Alzheimer's and Down syndrome but not in schizophrenia human brain〔J〕.Eur J Neurosci，2004;19(10):2711-9.

4 Smith DH，Okiyama K，Thomas MJ，et al.Evaluation of memory dysfunction following experimental brain injury using the Morris water maze〔J〕.Neurotrauma，1991;8(4):259-69.

5 Deller T，Nitseh R.Associational and commissural afferents of parvdlbumin-immunoreactive neurons in the rat hippocampus:a combined immunocytochemical and PHA-L study〔J〕.ComP Neurol，1994;350(4):612-22.

6 袁 輝，楊 勝，周文霞，等.MAPK級聯(lián)信號通路與長時程增強〔J〕.中國藥理學通報，2006;22(7):769-74.

7 Berkeley JL，Comeza J，Wess J，et al.1M1 muscarinic acctylcholine receptors activate extracellular signial regulated kinase in CA1 pyram idal neurons in mouse hippocampal slices〔J〕.Mol Cell Neurosci，2001;18(5):512-24.

8 胡亞卓，王雪笠，呂佩源.血管性癡呆小鼠海馬p38絲裂原活化蛋白激酶免疫組織化學表達及多奈哌齊的干預作用〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(23):3074-6.

9 Blennow K，Deleon MJ，Zetterberg H.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2006;368(9533):387-403.

10 Dawson GR，Seabrook GR，Zheng H，et al.Age-related cognitive deficits，impaired long-term potentiation an reduction in synaptic marker density in mice lacking the β-amyloid precursor protein〔J〕.Neuroscience，1999;90(1):1-13.

11 Liu Y，Walter S，Cherny D，et al.LPS receptor(CD14):a receptor for phagocytosis of Alzheimer's amyloid peptide〔J〕.Brain，2005;128(8):1778-89.

12 Li Y，Liu L，Kang J，et al.Neuronal-glial interactions mediated by interleukin-1 enhance neuronal acetylcholinesterase activity and mRNA expression〔J〕.Neurosci，2000;20(1):149-55.