鴨甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

藏玉婷，王彬，宋揚(yáng)，丁國杰

鴨甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

藏玉婷，王彬，宋揚(yáng)，丁國杰?

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心，哈爾濱150069）

通過PCR技術(shù)，從自行分離的鴨甲肝病毒JS株基因組中擴(kuò)增出病毒衣殼蛋白VP1完整基因片段，并對該片段進(jìn)行序列測定及分析。結(jié)果顯示JS－VP1與DHAV－A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%～64.4%之間，與DHAV－B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%～63.8%之間，與DHAV－C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%～98.5%之間，分析表明JS株為鴨甲肝病毒基因C型，血清型分型為韓國新型。進(jìn)化樹表明JS株與SD02株的親緣關(guān)系較進(jìn)，進(jìn)一步說明VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因組中的高度可變區(qū)，可作為DHAV基因型研究的標(biāo)記，分離毒株為DHAV的防治及疫苗的設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

鴨甲肝病毒；VP1基因；序列分析

鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）是小RNA病毒科禽肝病毒屬成員，鴨甲肝病毒可引起鴨病毒性肝炎，鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要傳染病。其中，DHAV分為血清1型、“臺灣新型”和“韓國新型”，對應(yīng)于基因A型（DHAV－A）、B型（DHAV－B）和C型（DHAV－C）［1－2］。近兩年來，我國許多養(yǎng)鴨地區(qū)同時流行DHAV－A和DHAV－C［3］。由于不同型DHAV之間缺乏交叉保護(hù)，而我國多數(shù)鴨場只針對DHAV－A采取措施，因此我國現(xiàn)地流行株主要為DHAV－C，并給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。VP1（Viral protein 1）蛋白包含了小RNA病毒的主要抗原位點(diǎn)及細(xì)胞膜受體結(jié)合位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體［4］，因此，VPl基因核苷酸序列同源分析比較，已成為不同DHAV毒株血清型分型的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步研究DHAV毒株的分子生物學(xué)特性、變異趨勢，本研究于2009年在江蘇省某鴨場分離病毒DHAV－JS株，并對所分離到的JS株VP1基因進(jìn)行序列分析，從分子水平研究其基因特征，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料取自江蘇省徐州市某鴨場疑似鴨病毒性肝炎的病死鴨。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)鴨胚 10日齡SPF鴨胚，購自中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.3 引物及主要試劑 根據(jù)文獻(xiàn)［5］合成引物DHAV－A VP1引物序列P1：5’－GGTGATTCTAAC?CAGTTGG－3’，P2：5’－TTCAATTTCCAGATTGAGT－3’，DHAV－C VP1引物序列P3：5’－CAGATGGCCGCCAAT?GATCAG－3’，P4：5’－GTCTCTGACATTTCGAAATTGG?TATGA－3’，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker、PMD18－T載體、感受態(tài)DH5α、限制性內(nèi)切酶Hin dⅢ、Bam HⅠ均購自大連寶生物有限公司；病毒RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖、膠回收試劑盒購自上海華舜生物有限公司；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將病變肝臟、脾臟剪碎、研磨，用滅菌pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）作1∶5稀釋，經(jīng)3000 r／min離心30 min，取上清液加入抗生素，使每毫升組織液含有2000 IU青霉素和2000μg鏈霉素，于37℃溫箱作用30 min后按4∶1加入分析純?nèi)燃淄?，充分混勻后放?7℃溫箱作用60min，經(jīng)3000 r／min離心30min，取上清液經(jīng)無菌、支原體和外源病毒檢驗(yàn)合格后，作為接種用樣品。

1.2.2 病毒分離 用滅菌pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）將上述樣品做100倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF鴨胚，每胚0.2 mL，37℃培養(yǎng)7 d，記錄死胚情況。收集48～96 h死亡鴨胚的胚體及尿囊液。反復(fù)凍融3次，4000 r／min離心30min，取上清經(jīng)無菌、支原體和外源病毒檢驗(yàn)合格后，作為鴨胚毒，命名為DHAV－JS，－40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 參照病毒RNA提取試劑盒及M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行。合成的cDNA模板，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 VP1基因的PCR擴(kuò)增 按以下順序加入各溶液建立50μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 35μL、10×PCR Buffer 5μL、mix dNTP（2.5 mmol／L）4μL、上游引物（50 pmol／μL）1μL、下游引物（50 pmol／μL）1μL、 cDNA 3μL、Taq酶0.5μL。優(yōu)選的最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min、94℃變性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，共30個循環(huán)，72℃延伸10min。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 將PCR產(chǎn)物在1.0%糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，紫外投射儀上觀察與拍照，與DNA Marker比較。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的純化 將擴(kuò)增片段參照試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。

1.2.7 PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定 將PCR回收產(chǎn)物在16℃下連接到PMD18－T載體上，連接體系為：PMD18－T載體0.5μL；SolutionⅠ5μL；目的片斷4.5μL；連接時間為3 h。將連接產(chǎn)物10μL加入100μL的感受態(tài)菌DH5α中于37℃搖床培養(yǎng)1 h，涂布于AMP＋的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～18 h，挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中37℃擴(kuò)增培養(yǎng)10 h，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.8 基因序列測序和分析 將經(jīng)過鑒定確定為陽性的菌液寄送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，并將結(jié)果用DNASTAR軟件進(jìn)行序列分析，參考序列見表1。

表1 參考序列

續(xù)表

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分析，擴(kuò)增出約714 bp左右的片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 JS－VP1同源性比較及基因進(jìn)化樹分析 將JS－VP1的基因序列與參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，JS－VP1與DHAV－A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%～64.4%之間，與DHAV－B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%～63.8%之間，與DHAV－C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%～98.5%之間（表2）。進(jìn)化樹分析表明，所分離到的JS株與SD02株（DHAV－C）的親緣關(guān)系較近（圖2）。

表2 不同毒株的VP1基因序列比較分析%

3 討論

VP1蛋白被普遍認(rèn)為是小RNA病毒的最重要的抗原蛋白，編碼該蛋白的VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因組中的高度可變區(qū)［6－7］。不同血清型DHAV的抗原性主要與病毒的表面結(jié)構(gòu)蛋白VPl有關(guān)。本試驗(yàn)根據(jù)序列測定及分析表明，JS－VP1的基因與DHAV－A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%～64.4%之間，與DHAV－B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%～63.8%之間，與DHAV－C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%～98.5%之間，依據(jù)同屬小RNA病毒的人腸病毒血清型分型標(biāo)準(zhǔn)，即VPl蛋白的核苷酸同源性≥75%和／或氨基酸同源性≥88%即可判定為同一血清型［8］，對VP1核苷酸序列同源性比較表明，JS株與DHAV－C屬于同一血清型，而與DHAV－A和DHAV－B屬于不同的血清型。

本試驗(yàn)將JS－VP1與不同地區(qū)和不同時間分離發(fā)表的DHAV－VP1序列比較，進(jìn)化樹分析表明，JS株與SD02株（中國）、AP－04009株（韓國）及B63株（中國）等基因序列的同源性均在96%以上，表明DHAV－C的分子流行相對較穩(wěn)定，病毒的變異較小，這為我國對該病的診斷和防制提供了重要的依據(jù)。

彭小薇等指出近年來DHAV－C或韓國新型在我國的地區(qū)分布已較為廣泛，我國許多鴨場針對傳統(tǒng)的DHAV－A采取措施后仍發(fā)生鴨病毒性肝炎的根本原因是DHAV－A及DHAV－C在我國許多養(yǎng)鴨地區(qū)的同時流行［9］。目前市場上尚無DHAV－C疫苗，該試驗(yàn)結(jié)果可指導(dǎo)疫苗及診斷試劑的研發(fā)，對疾病的防控具有重要意義。

圖2 JS－VP1基因與參考毒株進(jìn)化樹分析

［1］ Tseng CH，TsaiH J.Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus［J］.Virus Res，2007，126：19－31.

［2］ Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al.Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno and serotype when compared to duck hepatitis virus type1 type strains［J］.Arch Virol，2007，152：2059－2072.

［3］ 張大丙.鴨甲肝病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（3）：59－60.

［4］ Oberste M S，Maher K，Kilpatrick DR，et a1.Molecular evolution of the human enteroviruses：correlation of serotype with VPI sequence and application to picomaviruses［J］.J Virol，1999，76：1244－1251.

［5］ 范書才，李虹，袁率珍，等.新型鴨肝炎病毒的分離鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31（10）：770－775.

［6］ Liu G，Wang F，Ni Z，etal.Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus typeⅠ（DHV－Ⅰ）isolates from southeast China is related to isolate attenuation［J］.Virus Res，2008，137（1）：137－141.

［7］ 邵澤香，韋強(qiáng)，鮑國連，等.鴨肝炎病毒浙江分離株全基因組測序及其VP1基因的序列分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（8）：1052－1055.

［8］ Oberste M S，Maher K，Kilpatrick D R，et al.Molecular evolution of the human enteroviruses：correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification［J］.J Virol，1999，73（3）：1941－1948.

［9］ 彭小薇，徐永亮，王笑言，等.鴨甲肝病毒VP1基因的克隆和序列分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45（9）：18－19.

（編輯：李文平）

Clone and Sequence Analysis of VP1 Gene of Duck Hepatitis A Virus

ZANG Yu－ting，WANG Bin，SONG Yang，DING Gou－jie?
（Harbin Pharmaceutical Group Co Ltd Biological Vaccine，Harbin 150069，China）

VP1 gene of duck hepatitis A virus was amplified from the gene by PCR，and then sequenced.The result of sequence analysis showed that the gene of VP1 of JS strain and DHAV－A shared identities of 62.0%～64.4%，DHAV－B shared identities of 63.6%～63.8%，and DHAV－C shared identities of 92.3%～98.5%which showed that JS strain was DHAV－C and a new serotype strain in Korea.Phylogenetic analysis showed that it had the closest relationship with SD02 strain.This conclusion further illustrated that the nucleotide sequence of VP1 gene was highly variable area of DHAV，and could be used as DHAV genotype research.The isolate will lay a theoretical basis for the disease prevention and vaccine design.

DHAV；VP1 gene；sequence analysis

2014－10－14

A

1002－1280（2015）02－0018－04

S858.32

藏玉婷，碩士，從事獸用疫苗研制工作。

丁國杰。E－mail：445298136＠qq.com