有氧運動抗ＡｐｏＥ－／－小鼠動脈粥樣硬化的Ｌ－精氨酸機制探討

張　靚　黃叔懷　曾柏生

摘要：目的：以ApoE基因缺陷小鼠為動脈粥樣硬化模型，觀察有氧運動對小鼠動脈粥樣硬化斑塊的作用，及運動對血漿一氧化氮（nitric oxide，NO）、血漿L-精氨酸（L-arginine, L-Arg）與不對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethlarginine，ADMA）比值的影響，以探討NO及其底物L-Arg在運動抗動脈粥樣硬化中的作用。方法：ApoE基因缺陷小鼠隨機分為安靜對照組和運動組（游泳運動，2 h/次，5次/周，共10周），分別測定粥樣斑塊面積，采用硝酸還原酶法測定血漿中NO水平，利用高效液相法測定血清中ADMA與L-Arg的水平，另對血清肌酐和腎臟超微結構進行觀察。結果：與對照組相比，運動組小鼠斑塊面積顯著減小40%（P<0.01），小鼠血漿NO水平升高15倍（P<0.01），L-Arg/ADMA比值顯著升高10%（P<0.05）。結論：有氧運動使血漿L-Arg/ADMA比值升高，促進L-Arg的利用，NO合成增多，可能是運動抗動脈粥樣硬化的機制之一。

關鍵詞：有氧運動；動脈粥樣硬化；ADMA；L-Arg

中圖分類號：G804.2文獻標識碼：A文章編號：1007-3612(2008)03-0336-03

大量流行病學資料表明，有氧運動是防治動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的有效措施。運動可通過調節(jié)脂代謝、提高機體抗氧化能力等機制減輕動脈粥樣硬化損傷。自1987年氣體小分子一氧化氮（nitric oxide, NO）被發(fā)現(xiàn)后，立即成為動脈粥樣硬化發(fā)病機制研究的新靶點。大量研究表明一氧化氮除了促進血管舒張之外，還具有抗氧化、阻止血小板聚集和單核細胞粘附、抑制平滑肌細胞增值等多種作用，是一種公認的抗動脈粥樣硬化因子，動脈粥樣硬化時NO系統(tǒng)功能紊亂已成為動脈硬化的發(fā)病機制之一。

L－精氨酸（L-Arginine，L-Arg）是合成NO的底物，在一氧化氮合酶的作用下，生成一氧化氮和L－瓜氨酸。當機體L-精氨酸利用遇到障礙時，一氧化氮合成減少，是動脈粥樣硬化時NO系統(tǒng)功能紊亂的重要原因。近期研究表明動脈粥樣硬化時存在L-Arg的相對不足，即L-Arg的含量并沒有顯著性變化，但L-Arg的利用確顯著降低。目前研究提示L-Arg進入細胞被進一步利用是通過L-Arg轉運體來實現(xiàn)的，其轉運速率并不僅依賴于L-Arg的濃度，還受多種因素調節(jié)，如切應力等。此外L-Arg與一氧化氮合酶的親和力的變化也是影響L-Arg利用的原因。近年來一氧化氮合酶內源性抑制劑的發(fā)現(xiàn)為L-Arg利用障礙的研究提供了新的途徑。

內源性一氧化氮合酶抑制劑為L-精氨酸的同系物，包括單甲基精氨酸（L-NMMA）和二甲基精氨酸（包括ADMA和SDMA，SDMA不具有活性），其中研究較多的是不對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethlarginine，ADMA），其與L-精氨酸競爭性的抑制一氧化氮合酶活性，減少NO的生成，現(xiàn)認為ADMA升高是動脈硬化新的危險因子。

本工作以ApoE基因缺陷小鼠為動脈粥樣硬化模型，觀察有氧運動對小鼠動脈粥樣硬化斑塊的作用，及運動對血漿NO、血漿L-Arg與ADMA比值的影響，以探討NO及其底物L-Arg在運動抗動脈粥樣硬化中的作用。

1材料和方法

1.1材料8周齡ApoE基因缺陷小鼠由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，恒定室溫下飼養(yǎng)，每12 h晝夜交替光照，飼以“西方膳食”飼料（膽固醇0.15%，脂肪21%），自由飲水。一氧化氮測定試劑盒由南京聚力生物醫(yī)學工程研究所提供，ADMA及L-Arg標準品均購自Sigma公司。其余為市售分析純產品。

1.2運動模型的制備及分組取相同8周齡大鼠實驗共有兩組（n＝6）：1) ApoE基因缺陷對照組：不運動的ApoE基因缺陷小鼠；2) ApoE基因缺陷運動訓練組：進行無負重游泳運動，游泳槽深60 cm，水溫保持在(31±1)℃。游泳運動共持續(xù)11周，每周5次，每次120 min，每次游泳都在同一時間進行（15:00-17:00），有氧運動時間參照李暉等報道。游泳訓練的第一周為適應性訓練，由最初的15 min直至120 min，每天遞加。全部動物于ApoE基因缺陷末次運動后24 h，摘眼球取血；取左側腎臟，預固定；迅速打開胸腔，連同心臟及主動脈取出，固定于蠟塊平皿，解剖鏡下去除結締組織，液氮保存，用于下述測定。

1.3油紅O染色測定斑塊面積根據(jù)Paigen B等方法進行。以兩心房尖為點所連成的直線部位，去除以下心室，然后裝臺，OCT包埋后，進行冰凍切片。切片厚度為8 μm，從主動脈瓣即將消失的部位開始向升主動脈方向取片，每隔一張取片，所取得的切片，進行油紅O染色及HE復染后，每隔5張取一張參與評估，共取5張，利用計算機模擬圖象分析（CMIAS-998型圖象分析系統(tǒng)）對油紅O染色部位進行面積估算。

1.4高效液相法測定血漿L-Arg和ADMA水平根據(jù)文獻介紹的方法［1］，處理樣品。按1 mL血清加入20 mg 5－磺基水楊酸（salicylsulfonic acid，SSA）的比例在樣品中加入5－SSA沉淀蛋白，冰浴反應10 min，離心（2 000 g,10 min），吸取上清液，經0.45 μm 的濾膜過濾后待測。L－Arg和ADMA標準品用50％甲醇配成100 mg/mL左右濃度的儲備液，－20℃儲存。臨用前用人工腦脊液（NaCl 7.605 g,KCl 0.223 g,NaH₂PO4·2H₂O 0.072 g, NaHPO4·12H₂O 0.014 g, NaHCO₃ 2.1 g,MgCl2·6H₂O 0.162 g, CaCl2 0.144 g,溶解后定容至1 000 mL，pH 7.4）稀釋后測定，稀釋倍數(shù)分別為80倍，200倍，400倍，800倍和1 600倍。將27 mg鄰苯二甲醛（OPA）溶于0.5 mL甲醇中，再加入2－巰基乙醇（2－MCE）20 μL,加入0.1 mmol/L四硼酸鈉緩沖液（pH 9.5）至5 mL制得衍生液，避光室溫保存。上樣前將20 μL標準液或樣品液與10 μL衍生液混勻，精確反應90 s，進樣20 μL。流動相包括四種，各自成分如下：流動相A：100％甲醇，流動相B：純水，流動相C：25％甲醇，3％四氫呋喃，72% 0.05M PBS，流動相D：70％甲醇，3％四氫呋喃，27% 0.05M PBS，流動相均經0.45 μm濾膜過濾，超聲波脫氣后使用。采用Waters HPLC系統(tǒng)，分析柱為Inertsil ODS-2，流速為1 mL/min，溫度為30℃，熒光檢測調節(jié)為激發(fā)光338 nm、發(fā)射光425 nm。

根據(jù)標準品作出標準曲線，計算出函數(shù)，將所測樣品的峰面積分別代入函數(shù)，計算L-Arg及ADMA水平。

1.5透射電鏡觀察腎臟超微結構腎臟組織經1％鋨酸固定，磷酸緩沖液沖洗，分別以50％、70％、90％、100％乙醇依次脫水，環(huán)氧樹脂包埋。光鏡下修塊、定位，然后制超薄切片，片厚50 nm，用醋酸雙氧鈾染核結構，檸檬酸鉛染膜結構，于透射電子顯微鏡下觀察腎小球結構。

1.6其他測定血漿NO水平采用硝酸還原酶發(fā)測定，血漿肌酐水平采用苦味酸法測定。

1.7統(tǒng)計學分析實驗結果以均數(shù)±標準差（X±s）表示。組間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1有氧運動對小鼠動脈粥樣硬化損傷的影響與安靜對照組相比，運動組小鼠主動脈粥樣斑塊面積縮小40%（1 835．0±401.46 vs 1 131.8±240.06，P<0.01）(圖1)。

圖1ApoE基因缺陷小鼠主動脈冠狀面油紅O染色觀察。

A為安靜組，B為運動組（10×）2.2有氧運動對小鼠血漿L-Arg/ADMA比值、NO水平的影響與對照組相比，運動組血漿NO水平顯著升高15倍（P<0.01），血漿L-Arg水平無顯著變化，但血漿ADMA水平顯著降低8%（P<0.05），因而血漿L-Arg/ADMA比值升高10%（P<0.05）（表1）。血漿NO水平與L-Arg/ADMA比值呈顯著正相關（r＝0.867，P<0.05）。

2.3有氧運動對小鼠腎臟超微結構的影響與對照組相比，運動組血漿肌酐水平無顯著變化〔（43.863±4.879)μmol/L vs(43.067±5.381)μmol/L，P>0.05）〕。對兩組腎小球濾過膜的結構觀察發(fā)現(xiàn)，腎小球濾過膜均勻、完整、無增厚；內皮細胞扁平，胞核清晰，內皮孔明顯，分布均勻；基膜均勻無增厚；足細胞正常大小，足突無腫大，均勻排布于基膜外側。兩組透射電鏡觀察結果一致，無差別（圖2）。

3討論

L－Arg是一氧化氮合酶的底物，在酶的作用下，生成一氧化氮和L－瓜氨酸，當L-Arg缺乏時，NO的合成減少。對血漿中L-Arg水平測定發(fā)現(xiàn)，與正常動物相比，動脈硬化模型動物血漿中的L-Arg濃度沒有顯著的改變。但給予動脈粥樣硬化或高脂血癥的動物飲食補充L－Arg，卻能夠阻止病變發(fā)展。有研究報道［2］，補充L-Arg顯著減小低密度脂蛋白受體敲除小鼠的動脈粥樣硬化損傷面積，并完全阻斷斑塊的發(fā)展。L-Arg補充改善了膽固醇喂養(yǎng)的兔動脈硬化模型NO依賴性血管舒張［3］，抑制血管壁細胞增生，抑制血管單核細胞的聚集［4］，使內膜增生顯著減少，改善動脈硬化［5］。血漿L－Arg水平與L-Arg利用之間存在的矛盾現(xiàn)象提示，動脈硬化時，L－Arg利用存在障礙。

國內學者采用Pic-TagTM氨基酸分析法［6］發(fā)現(xiàn)給家兔飼以高膽固醇飼料三個月，可使家兔主動脈壁L-Arg水平顯著降低。血漿中的L－Arg進入細胞被利用，是通過L-Arg轉運體來實現(xiàn)的。轉運多具有飽和性，在內皮細胞中，轉運速率并不僅依賴于細胞內L-Arg濃度，還有多種調節(jié)因子，其中剪切力是一個重要因素。此外，動脈粥樣硬化時，NOS與L-Arg的親合力下降［7］，也是導致L-Arg利用障礙之一。近期，一氧化氮合酶內源性抑制劑（ADMA）的研究為體內LArg的利用障礙提供了新的解釋。

ADMA是L－Arg的同系物，可競爭性的抑制一氧化氮合酶的活性，使體內NO的合成減少，在多種心血管疾病中均存在血漿ADMA的水平升高的現(xiàn)象。ADMA能直接作用血管，引起血管收縮，導致內皮功能紊亂［8，9］；另有實驗發(fā)現(xiàn)，在離體培養(yǎng)的內皮細胞孵育液中，加入一定量的ADMA后，單核細胞趨附蛋白－1表達增加，促進細胞黏附［10］。在對高膽固醇血癥患者注射L-Arg后，血漿L-Arg水平升高，ADMA無顯著變化，L-Arg/ADMA比值升高，部分恢復了NO的活性及內皮功能［11］。血漿L-Arg/ADMA比值是間接反映NO合成情況的一個指標。運動對血漿ADMA水平的影響目前尚不清楚。

本工作以ApoE基因缺陷小鼠為動脈粥樣硬化模型，飼以“西方膳食”，19周后均于主動脈弓處出現(xiàn)顯著的動脈硬化斑塊損傷。10周的有氧運動顯著減小了主動脈粥樣硬化斑塊面積，抑制了動脈粥樣硬化的發(fā)展。有氧運動顯著升高血漿NO水平，提示有氧運動促進了動脈硬化小鼠NO的合成。此外有氧運動抑制了ADMA的合成，顯著升高血漿L-Arg/ADMA比值，并與血漿NO水平呈顯著正相關，表明運動通過抑制ADMA的合成，促進L-Arg的利用，改善了動脈粥樣硬化時NO系統(tǒng)的功能，從而發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化的作用。

影響體內ADMA水平的可能原因大致有以下四個方面：首先是二甲基精氨酸二甲氨水解酶（DDAH），其降解ADMA，生成二甲胺和L-瓜氨酸，廣泛存在于人血管內皮細胞和肝、腎、腦等組織細胞內，其活性影響ADMA的水平［12］；其次甲基轉移酶，蛋白精氨酸甲基轉移酶（PRMTs）在人類已分離出四種亞型，其催化蛋白精氨酸甲基化，甲基化的蛋白質水解后，釋放出游離的ADMA；甲基轉移酶活性的變化也是致使內源性NOS抑制劑水平升高的機制之一［13］。第三，脂質過氧化誘導內源性NOS抑制物水平升高，抗氧化劑維生素E使ADMA水平下降［14］，同時，Ach誘導的離體胸主動脈內皮依賴的血管舒張改善；最后，腎功能的狀況，體內ADMA的代謝有部分是通過尿液排出體外，當腎功能下降時，排泄障礙，從而使血漿中ADMA積聚，濃度升高。此時，血漿ADMA濃度與血漿肌酐濃度成正比。

在本實驗中，為了探討運動的影響ADMA合成的機制，對ApoE基因缺陷小鼠血漿肌酐及腎臟的超微結構進行了觀察，實驗結果表明，肌酐水平在兩組之間無顯著差異，電鏡觀察的結果同樣表明，運動組和安靜組腎臟超微結構均無任何病變跡象，表明本工作中ADMA水平的變化與腎功能無關。運動是通過何種機制影響ADMA的水平，還需進一步實驗研究。

4結論

本工作發(fā)現(xiàn)，有氧運動通過抑制ADMA的合成，促進L-Arg的利用，改善了動脈粥樣硬化時NO系統(tǒng)的功能，可能是其發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化作用的機制之一。

參考文獻：

［1］ Chen BM,Xia LW,Zhao RQ.Determination of NG,NG-dimethylargingine in human plasma by high-performance liquid chromatography.Journal of chromatography B,692(1997)467-471.

［2］ Aji W, Ravalli S, Szabolcs M et al. L-arginine prevents xanthoma development and inhibits atherosclerosis in LDL receptor knockout mice. Circulation1997 Jan 21;95(2):430-7.

［3］ Boger RH, Bode-Boger SM, Brandes RP et al. Dietary L-arginine reduces the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits: comparison with lovastatin. Circulation1997 Aug 19;96(4):1282-90.

［4］ Boger RH, Bode-Boger SM, Kienke S et al. Dietary L-arginine decreases myointimal cell proliferation and vascular monocyte accumulation in cholesterol-fed rabbits. Atherosclerosis1998 Jan;136(1):67-77.

［5］ Cooke JP, Singer AH, Tsao P et al. Antiatherogenic effects of L-arginine in the hypercholesterolemic rabbit. J Clin Invest1992 Sep;90(3):1168-72.

［6］ 楊永宗，氧和平，戴愛國，等.L－精氨酸/一氧化氮抗動脈粥樣硬化的作用及機理［J］.中國動脈硬化雜志，1997，5（3）：258.

［7］ Cooke JP. Is atherosclerosis an arginine deficiency disease? J Investig Med1998,46(8):377-80.

［8］ Faraci FM et al. Response of cerebral blood vessels to an endogenous inhibitor of nitric oxide synthase. Am J Physiol1995 Nov;269(5 Pt 2):H1522-7.

［9］ Segarra G et al. Effects of some guanidino compounds on human cerebral arteries. Stroke1999 oct;30(10):2206-10; discussion 2210-11.

［10］ Boger RH et al. An endogenous inhibitor of nitric oxide synthase regulates endothelial adhesiveness for monocytes. J Am Coll Cardiol2000 Dec;36(7):2287-95.

［11］ Boger RH et al. Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction: its role in hypercholesterolemia. Circulation1998 Nov 3;98(18):1842-7.

［12］ Ito A et al.Novel mechanism for endothelial dysfunction: dysregulation of dimethylarginine dimethylaminohydrolase. Circulation1999 Jun 22;99(24):3092-5.

［13］ Boger RH et al. LDL cholesterol upregulates synthesis of asymmetrical dimethylarginine in human endothelial cells: involvement of S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases. Circ Res2000，21;87(2):99-105.

［14］ Xiong Y et al. Endogenous inhibitors of nitric oxide synthesis and lipid peroxidation in hyperlipidemic rabbits. Zhongguo Yao Li Xue Bao1996 Mar;17(2):149-52.

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