基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡三參湯治療缺血性心律失常的作用機(jī)制

冉俊寧，馮君，黃巍，唐聰聰，劉慧慧，王偉松，劉建和*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

心律失常是心臟起搏和傳導(dǎo)功能紊亂而發(fā)生的心臟節(jié)律、頻率或激動順序異常[1]。研究表明，約有90%急性心肌梗死的患者出現(xiàn)不同程度的心律失常，而急性心肌梗死的發(fā)病率隨著老齡化、生活習(xí)慣改變、社會心理等諸多因素的影響呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2-3]。缺血性心律失常(ischemic arrhythmias,IA)是冠心病比較常見的并發(fā)癥，是心源性猝死發(fā)生的重要原因，發(fā)病率高，嚴(yán)重威脅著人類的健康[4-5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)、藥物生物化學(xué)及多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過構(gòu)建藥物、靶點、通路、疾病的相互網(wǎng)絡(luò)來探討藥物的作用機(jī)制[6-7]。中藥治療疾病具有多活性成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)的特點，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運(yùn)用于中藥作用機(jī)制的研究，有利于了解中藥治病的整體性和系統(tǒng)性[8]。

缺血性心律失常屬于中醫(yī)“心悸”的范疇，基本病機(jī)為少陽不和,治法主要為和解定悸[9]。柴胡三參湯是導(dǎo)師劉建和教授其師在小柴胡湯基礎(chǔ)上加減而來的，全方合用共奏和解定悸、清心活血、益氣化痰之功效，臨床運(yùn)用于缺血性心律失常的治療，療效顯著[10]，其機(jī)制可能是柴胡三參湯多靶點、多通路共同作用的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 柴胡三參湯活性成分篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺[11](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)是一種獨特的中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺，它能捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系。本研究通過在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)平臺分別輸入柴胡三參湯中柴胡、黃芩、半夏、丹參、苦參、黨參、青蒿、甘草8味藥物檢索其活性成分，并對活性成分進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：口服利用度(OB)>30%，藥物相似性(DL)>0.18[12]。將同時滿足OB>30%、DL>0.18的活性成分篩選出來，作為候選活性成分。

1.2 活性成分靶點的預(yù)測

將候選的活性成分的名稱輸入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫平臺，獲得各活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，無法在PubChem獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)式的活性成分則剔除，分別將各活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式輸入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測，即可得到各活性成分的靶點信息，無法在Swiss Target Prediction預(yù)測到的活性成分也剔除，整理所獲得的靶點，刪除重復(fù)的靶點[13-14]。

1.3 缺血性心律失常疾病靶標(biāo)的收集

通過GeneCards[15](https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫對缺血性心律失常的英文名稱ischemic arrhythmias進(jìn)行檢索,即可得到缺血性心律失常的靶點信息，將靶點信息導(dǎo)入Excel2016進(jìn)行處理，設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為Relevance score>10,即可得到缺血性心律失常的疾病靶標(biāo)。

1.4 共同靶點篩選

利用在線作圖平臺(http://bioinfo.genotoul.fr/jvenn/example.html)將柴胡三參湯活性成分的靶點與缺血性心律失常疾病靶點進(jìn)行映射構(gòu)建韋恩圖，分別以CHSS、IA表示柴胡三參湯、缺血性心律失常，得到共同靶點，這些靶點可能是柴胡三參湯治療缺血性心律失常的關(guān)鍵靶點。

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將獲得的共同靶點導(dǎo)入STRING[16](https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins，限定物種為Homo sapiens，進(jìn)行共同靶基因間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，各蛋白相互作用的信息在數(shù)據(jù)庫中以置信度分值表示，置信度0.4以上表示有互作關(guān)系，故設(shè)定置信度為中等(medium confidence>0.4)，其他參數(shù)不變，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI，protein-protein interaction)。并將node1、node2、Combined score 值導(dǎo)出，運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件得到各靶點的degree值，將其導(dǎo)出在Excel2016繪制簇狀條形圖。

1.6 共同靶點GO功能注釋和KEGG富集分析

運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件中的插件ClueGo[17]對篩選出的共同靶基因進(jìn)行GO生物學(xué)功能注釋，對共同靶點進(jìn)行富集分析，保留P≤0.05的結(jié)果，并對圖形進(jìn)行可視化處理，分析柴胡三參湯治療缺血性心律失?？赡艿纳镞^程。同時將共同的靶點文件導(dǎo)入DAVID[18](https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)定篩選篩選條件為P<0.05、Count=2，得到分析結(jié)果,將KEGG通路富集分析結(jié)果導(dǎo)出在Excel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并繪制KEGG通路簇狀條形圖，然后將處理好的數(shù)據(jù)在imageGP[19](http://www.ehbio.com)在線平臺上進(jìn)行分析，作出KEGG通路富集氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 柴胡三參湯活性成分信息

該研究在TCMSP平臺，運(yùn)用篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到活性成分311種，刪除重復(fù)活性成分27種、在PubChem未搜索到化學(xué)結(jié)構(gòu)式及在Swiss Target Prediction未預(yù)測到靶點的活性成分69種后，得到柴胡三參湯八味中藥215種活性成分，其中半夏12種、柴胡14種、丹參38種、黨參13種、甘草74種、黃芩27種、苦參26種、青蒿11種。

2.2 活性成分靶點預(yù)測

將215種柴胡三參湯的活性成分在PubChem獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)式，并在Swiss Target Prediction進(jìn)行靶點預(yù)測，共得到靶點23 884個，去重后得到柴胡三參湯活性成分相關(guān)靶點1 319個。

2.3 缺血性心律失常疾病靶點的獲得

在GeneCards數(shù)據(jù)庫平臺對缺血性心律失常(ischemic arrhythmias)的疾病靶點進(jìn)行檢索，運(yùn)用篩選標(biāo)準(zhǔn)后，共獲得120個相關(guān)靶標(biāo)。

2.4 共同靶點的獲取

將缺血性心律失常的120個疾病相關(guān)靶點與柴胡三參湯活性成分的1 319個靶點輸入在線作圖平臺繪制韋恩圖(圖1)，其中IA代表缺血性心律失常，CHSS代表柴胡三參湯，兩類靶點取交集后即可的到疾病-活性成分共同靶點43個，此即是柴胡三參湯治療缺血性心律失常有重要意義的靶點。

圖1 缺血性心律失常靶點與柴胡三參湯成分靶點韋恩圖

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點的篩選

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)平臺分析輸入的43個共同靶點后得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，共獲得相互作用節(jié)點43個和相互作用關(guān)系370條，具體見圖2。并將STRING數(shù)據(jù)平臺中得到的結(jié)果node1、node2、Combined score 值導(dǎo)出，運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件計算出每個靶點的degree，將結(jié)果導(dǎo)出到Excel2016，將degree值的前20繪制成簇狀條形圖(圖3)，通過degree值測算出柴胡三參湯治療缺血性心律失常的重要靶標(biāo)，分別為白蛋白(ALB)、白細(xì)胞介素-6(IL6)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、一氧化氮合成酶3(NOS3)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管緊張素1轉(zhuǎn)化酶(ACE)、Serpin家族E成員1(SERPINE1)、激肽原1(KNG1)等。

2.6 共同靶點GO生物功能注釋

運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件中的插件ClueGo對缺血性心律失常與柴胡三參湯活性成分的43個共同靶點進(jìn)行GO生物功能注釋，保留P<0.05的結(jié)果，進(jìn)行可視化的處理，得到GO富集分析的網(wǎng)絡(luò)圖(圖略)和餅狀圖(圖4)，網(wǎng)絡(luò)圖中生物過程不同表示的顏色深淺不同，節(jié)點大小表示調(diào)控強(qiáng)弱，節(jié)點間連線表示相互作用。由圖可知共同靶點主要富集于活性氧代謝過程的積極調(diào)節(jié)(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)、調(diào)節(jié)血液凝固(regulation of blood coagulation)、調(diào)節(jié)血管直徑(regulation of blood vessel diameter)、調(diào)節(jié)血液循環(huán)(regulation of blood circulation)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)等221個生物過程。表明柴胡三參湯主要通過調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、血液凝固、血管直徑等生物過程來治療缺血性心律失常。

圖2 共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 degree值前20的共同靶點簇狀條形圖

圖4 共同靶點GO生物功能注釋餅狀圖

2.7 共同靶點KEGG通路富集分析

運(yùn)用DAVID對43個共同靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，通過篩選標(biāo)準(zhǔn)，將分析結(jié)果導(dǎo)出到Excel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，繪制KEGG通路富集簇狀條形圖(圖5)，其中X軸表示neglog10Pvalue值，Y軸表示通路的名稱。然后在imageGP 在線平臺對Excel2016處理過的KEGG通路富集分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到KEGG通路富集氣泡圖(圖6)，其中氣泡大小取決于Count值，顏色深淺取決于Pvalue值，X軸為關(guān)聯(lián)基因數(shù)與信號通路上總基因數(shù)的比值(Gene Ratio)，Y軸為通路名稱。由圖可知，共同靶點主要富集在補(bǔ)體和凝血級聯(lián)信號通路、肥厚性心肌病信號通路、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路、擴(kuò)張型心肌病信號通路、癌癥信號通路等14個信號通路。

圖5 KEGG通路富集簇狀條形圖

圖6 KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

柴胡三參湯具有和解少陽、養(yǎng)心定悸之功效，缺血性心律失常屬于中醫(yī)“心悸”的范疇，病機(jī)主要為少陽不和，故柴胡三參湯能夠在臨床有效的治療缺血性心律失常[20]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究表明，柴胡具有抗炎、降血脂、解熱、抗腫瘤等作用[21-22]，黃芩有降壓、抗心律失常、抗炎、抗腫瘤、保肝等作用[23-25]，半夏具有抗炎、抗腫瘤、止嘔等作用[26]，丹參具有抗動脈粥樣硬化、抑制心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌纖維化、抗心律失常等作用[27-28]，苦參具有抗心律失常、利尿、抗炎、調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)等作用[29]，黨參具有心血管保護(hù)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[30-31]，青蒿具有抗瘧、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[32]，甘草具有降血脂、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[33]。盡管柴胡三參湯的各個藥物的現(xiàn)代藥理研究已經(jīng)較為明確，但是其治療缺血性心律失常的機(jī)制還尚不完全明確。

本研究通過degree值測算出柴胡三參湯治療缺血性心律失常的前8個重要靶標(biāo)，分別為ALB、IL-6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1。ALB可影響營養(yǎng)代謝、組織液分布和底物轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)氧化還原電位、血漿膠體滲透壓，并介導(dǎo)對自由基和其他有害化學(xué)物質(zhì)的保護(hù)[34]。IL-6在免疫、組織再生和新陳代謝中均起作用，它的快速產(chǎn)生有助于宿主感染和組織損傷時的防御，但其過度合成或受體信號的失調(diào)與疾病病理有關(guān)[35]。AKT，又稱蛋白激酶B(PKB)，它可調(diào)節(jié)必需的細(xì)胞功能，如遷移、增殖、分化、凋亡和代謝等，并可影響各種促血管生成因子和抗血管生成因子的表達(dá)或活性，已經(jīng)提出Akt同種型Akt1是血管生成相關(guān)異常的治療靶標(biāo)[36]。一氧化氮(NO)作為重要的血管擴(kuò)張劑，在心血管穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，其中介體是由NOS1、NOS3、NOS2等合成的，其中NOS3是心血管系統(tǒng)中NO形成的最重要的亞型[37]。腫瘤壞死因子是一種多效細(xì)胞因子，在各種生理和病理條件下產(chǎn)生不同的刺激，它對T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞發(fā)育起重要作用，同樣也是炎癥介質(zhì)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑[38]。研究表明，ACE在調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)液體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[39]。SERPINE1可抑制尿激酶型纖溶酶原(uPA)和組織型纖溶酶原激活物(tPA)，減少纖溶酶原向活性蛋白酶纖溶酶的轉(zhuǎn)化[40]。激肽原1是參與腎功能、血壓、心功能及炎癥調(diào)節(jié)的重要因子[41]。故柴胡三參湯主要通過對ALB、IL6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1等靶點的調(diào)節(jié)來達(dá)到治療缺血性心律失常的作用。

富集分析的結(jié)果表明，治療過程中主要的通路可能是鈣信號通路、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路等[42]。其中鈣信號通路[43]、Toll樣受體信號通路[42,44]、細(xì)胞凋亡信號通路[45]是在缺血性心律失常中起重要作用的通路。缺血性心律失常是冠心病比較常見的并發(fā)癥。研究表明，在早期激活mTOR信號通路可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和更新，并修復(fù)其損傷，mTOR信號通路還可調(diào)節(jié)脂代謝和細(xì)胞自噬，故可發(fā)揮抗冠狀動脈粥樣硬化性和心律失常的作用[46]。VEGF可以促進(jìn)生理性或病理性血管的新生，是重要的血管生成促進(jìn)因子，通過降低或抑制VEGF的表達(dá)，可以減少血管新生，從而防治動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[47]。其中mTOR信號通路與VEGF信號通路又可相互影響[48]。本研究還發(fā)現(xiàn)柴胡三參湯治療缺血性心律失常主要與調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、血液凝固、血管直徑、血液循環(huán)、一氧化氮生物合成過程等生物過程相關(guān)。心肌缺血再灌注損傷可導(dǎo)致各種心律失常，其與自由基增多密切相關(guān)，而活性氧與一氧化氮均屬于自由基，對于心肌缺血再灌注損傷防治的關(guān)鍵在于盡早恢復(fù)血流、清除自由基等[49]。故柴胡三參湯可能主要通過恢復(fù)心肌血流、清除自由基等機(jī)制來治療缺血性心律失常。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，挖掘到柴胡三參湯215種活性成分及1 319個作用的靶點，缺血性心律失常疾病的靶點120個，藥物與疾病的共同的靶點43個，通過degree值測算、GO及KEGG富集分析，預(yù)測到柴胡三參湯可能是通過調(diào)控ALB、IL6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1等靶點，調(diào)節(jié)鈣，Toll樣受體，細(xì)胞凋亡，mTOR，VEGF等信號通路，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、恢復(fù)心肌血流、清除自由基等作用來治療缺血性心律失常。但由于各數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)、軟件功能的限制，應(yīng)以該研究結(jié)果作為基礎(chǔ)或線索，運(yùn)用實驗研究來對其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的論證。