轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在人類疾病動(dòng)物模型中的應(yīng)用

　　摘要：疾病動(dòng)物模型在認(rèn)識(shí)疾病本質(zhì)、確定防治方案及藥物研究上十分重要。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物人類疾病動(dòng)物模型的研究和建立在基因水平上研究人類疾病、揭示各個(gè)基因的各種功能中將起重大作用。本文列舉了國(guó)內(nèi)外學(xué)者構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的成果和進(jìn)展，提示轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型將在人類基因組計(jì)劃(HOP)的后基因組時(shí)代發(fā)揮其獨(dú)特、重大的作用。
　　關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；人類疾病動(dòng)物模型；應(yīng)用
　　中圖分類號(hào)；R—332
　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
　　文章編號(hào)：1007—2349(2007)06—0043—03
　　
　　1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
　　
　　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指基因組中穩(wěn)定整合有以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)人的外源基因或特定的DNA片段的動(dòng)物。1974年美國(guó)科學(xué)家Jaenisch把猿猴病毒40(sv40)注入小鼠囊胚腔得到部分體組織中含有sv40DNA的嵌合體小鼠，1976年他們利用反轉(zhuǎn)錄病毒與小鼠卵裂球共培養(yǎng)把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因組，建立了世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系嘲。1980年Gordon等將猿猴病毒和人單純皰疹病毒(HSV)的tk(thymiaine kinase)基因整合后的質(zhì)粒直接注入小鼠受精卵原核中，首次創(chuàng)建了顯微注射轉(zhuǎn)基因法。20多年來(lái)轉(zhuǎn)基因技術(shù)受到廣泛的重視和運(yùn)用并得到迅速發(fā)展，目前已經(jīng)制備出轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠、兔、魚(yú)、牛、豬、羊等多種動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因品系。
　　
　　2人類疾病動(dòng)物模型
　　
　　人類疾病的動(dòng)物模型(animal model of human disease)是指醫(yī)學(xué)研究中將動(dòng)物里的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象和相關(guān)材料。動(dòng)物模型在研究人類疾病中起著重大意義，避免人體實(shí)驗(yàn)造成的危害，提供發(fā)病率低、潛伏期長(zhǎng)和病程長(zhǎng)的疾病材料。可增加方法學(xué)上的可比性，研究人類疾病發(fā)生的分子機(jī)制、組織病理，以及藥物的治療效果等。目前人類疾病動(dòng)物模型的常規(guī)獲得方法有以下幾種。
　　2.1實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型又稱誘發(fā)性動(dòng)物模型，是指研究者通過(guò)使用物理的、化學(xué)的、生物的和復(fù)合的致病因素作用于動(dòng)物，造成動(dòng)物組織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時(shí)的功能、代謝或形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的疾病。例如切斷的冠狀動(dòng)脈分支復(fù)制心肌梗死模型。
　　2.2自發(fā)性動(dòng)物模型指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何處理，在自然條件下動(dòng)物自然發(fā)生，或由于基因突變的異常表現(xiàn)，通過(guò)育種保留下來(lái)的動(dòng)物模型，其中主要包括近交系的腫瘤疾病模型和突變系大遺傳疾病模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為人類疾病模型，可利用它來(lái)研究疾病發(fā)病機(jī)制、評(píng)估新藥療效。目前國(guó)內(nèi)外科技工作者已經(jīng)生產(chǎn)出一些人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。目前已應(yīng)用和公布的大部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型處在基礎(chǔ)研究而不是臨床研究。在臨床前研究中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為人類疾病模型可應(yīng)用的數(shù)量少，但不斷生產(chǎn)的模型被廣泛應(yīng)用于臨床前、藥物開(kāi)發(fā)。
　　
　　3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在人類疾病動(dòng)物模型的主要成果
　　
　　3.1在遺傳病中的應(yīng)用 以前關(guān)于遺傳疾病的動(dòng)物模型，一般僅靠自然界突變產(chǎn)生的動(dòng)物，經(jīng)過(guò)一代代的育種繁殖而保留下來(lái)的，而突變的發(fā)生率無(wú)疑是很低的。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型無(wú)論在數(shù)量上、與人類遺傳病近似程度上、品系保持上都具有無(wú)比的優(yōu)勢(shì)。
　　3.1.1先天愚型疾病將正常的Ca／Zn過(guò)氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，并使之過(guò)量表達(dá)，該小鼠就表現(xiàn)出與21三體綜合征相似的表現(xiàn)，因此該小鼠就可作為先天愚型(Dbwns綜合征)的動(dòng)物模型。3.1.2地中海貧血小鼠地中海貧血是一種常見(jiàn)的血液遺傳病，是由于球蛋白鏈合成速度降低，導(dǎo)致鏈和非鏈的合成不平衡，結(jié)果多余的蛋白珠鏈沉積在紅細(xì)胞膜上，改變了膜的通透性和硬度，導(dǎo)致溶血性貧血。地中海貧血可分為兩種主要類型：a—地中海貧血(珠蛋白鏈合成減少或缺少)和8—地中海貧血。李政建立帶紅系，增強(qiáng)子S’HS2的人β41／42珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，從而成功地復(fù)制了小鼠—β地中海貧血模型。自然產(chǎn)生的β—地中海小鼠為人β—地中海貧血的病理生理提供了有用的模型，可以做一些難以在病人身上完成的試驗(yàn)。將癌基因與特定的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子融合，引入動(dòng)物體內(nèi)，制備轉(zhuǎn)癌基因動(dòng)物，研究致癌機(jī)制。SV40Tag基因與胰島素基因增強(qiáng)子，引入小鼠體內(nèi)并在胰腺中表達(dá)SV40Tag，誘導(dǎo)了胰腺癌。
　　3.2傳染病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型一些傳染病病原體的致病病原體的致病機(jī)理、疫苗研制、藥物篩選等諸多項(xiàng)目的研究一直因缺乏經(jīng)濟(jì)可行的天然敏感動(dòng)物模型而受阻，如HBV、HDV、HZV、Polivovirus等自然狀態(tài)下均只能感染黑猩猩在內(nèi)的少數(shù)幾種靈長(zhǎng)類動(dòng)物，致力于對(duì)這些病原體敏感、廉價(jià)的動(dòng)物模型的尋找一直是各國(guó)學(xué)者堅(jiān)持不懈奮斗的目標(biāo)。正因?yàn)槿绱耍槍?duì)他們的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型就隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問(wèn)世應(yīng)用而產(chǎn)生了嘲，如乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染與慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV是一種宿主特異性極強(qiáng)的嗜肝病毒，制備部分HBV基因或HBV全基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠為研究HBV在宿主體內(nèi)的表達(dá)、包裝以及分泌等生物學(xué)的特性提供了良好的試驗(yàn)材料，也是抗HBV藥物和臨床相關(guān)疾病治療的理想動(dòng)物模型。早在1985年美國(guó)的Chisari等和法國(guó)的Rsbinet等同時(shí)在{Science》雜志上報(bào)道了他們通過(guò)受精卵原核內(nèi)顯微注射的方法建立了轉(zhuǎn)基因小鼠。第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)教研室胡以平等經(jīng)多年努力相繼構(gòu)建了HBVpres／s、HBV xdr亞型的轉(zhuǎn)基因小鼠，2003年胡以平等構(gòu)建HBV轉(zhuǎn)基因小鼠C57—TgN(HBc ayw)SMM，進(jìn)一步研究HBV各基因在體內(nèi)的特性以及乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core gene，HBc)基因在乙型肝炎病毒感染中的作用，并且對(duì)HBV核心抗原顆粒(HBcAg)在肝臟中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。但是通過(guò)生殖系所產(chǎn)生的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在出生前就能在內(nèi)源性HBV啟動(dòng)子的控制下，在肝臟內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在肝細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有HBsAg以亞病毒顆粒的形式以9000ng／nl的濃度分泌人血。這些小鼠對(duì)高水平的循環(huán)耐受，不產(chǎn)生HBs，可被用作HBV慢性攜帶狀態(tài)模型。
　　3.3在腫瘤方面的運(yùn)用腫瘤動(dòng)物模型最早源自小鼠自發(fā)突變或致癌劑誘變而得，但自發(fā)突變率在自然狀態(tài)下通常很低，而誘變模型也因其不可精確控制性而限制它們的應(yīng)用。在過(guò)去20多年間，隨著人們對(duì)癌基因的激活或抑癌基因失活在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用認(rèn)識(shí)日益深入，以及近年發(fā)展起來(lái)的在小鼠生殖系引入可誘導(dǎo)或精細(xì)調(diào)控突變技術(shù)的應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上腫瘤小鼠模型建立工作取得很大進(jìn)展。運(yùn)用轉(zhuǎn)基因方法建立了腦腫瘤動(dòng)物模型。
　　3.3.1首次報(bào)道的腦腫瘤模型采用SV40的早期區(qū)表達(dá)基因(即T—抗原和t—抗原基因)作為靶基因轉(zhuǎn)入小鼠而建立。
　　3.3.2制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型的方法主要有(1)肝炎病毒轉(zhuǎn)基因肝癌模型，構(gòu)建方法過(guò)程類似乙型肝炎轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立。(2)SV40轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型，Dubois等利用人ATⅢ基因和SV40T抗原(SV40—Tags)序列構(gòu)建外源DNA，建立SV40轉(zhuǎn)基因肝癌模型。(3)TGFa／C—myc轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型，由Murakami等人培育的Alb／c—myc轉(zhuǎn)基因小鼠和培育的MT／TGF轉(zhuǎn)基因小鼠交配獲得TGF／c—myc轉(zhuǎn)基因小鼠。(4)TGF／轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型，F(xiàn)ator等利用構(gòu)建的豬A1B／TGFl轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型，該模型的腫瘤平均潛伏期為16～18個(gè)月，腫瘤發(fā)生率為59％。
　　3.3.3前列腺癌轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在1996年Gringrich等將probasin的啟動(dòng)子中一段454個(gè)堿基的序列與SV40序列連接，轉(zhuǎn)入小鼠受精卵細(xì)胞，建立了轉(zhuǎn)基因NZXnK45kq05dhJHt7ZeVHg==小鼠前列腺癌動(dòng)物模型TRAMP(Transgenic adenoeardnoma mouse prostate)。
　　3.3.4轉(zhuǎn)基因胃癌模型直接調(diào)控胃癌的相關(guān)基因轉(zhuǎn)染到動(dòng)物胚胎中而形成腫瘤，如轉(zhuǎn)染了腺病毒12Ela／Elb轉(zhuǎn)基因大鼠在扁平上皮和圓柱形上皮的結(jié)合點(diǎn)附近形成了類似與自然發(fā)生的胃癌，同時(shí)Thompson等用長(zhǎng)424bp的CEA促進(jìn)劑SV40T抗原轉(zhuǎn)基因構(gòu)建了胃腺癌小鼠。
　　除上述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型外，科學(xué)工作者對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在人類疾病動(dòng)物模型的運(yùn)用做了大量的工作，所建立的轉(zhuǎn)基因人類疾病動(dòng)物模型不僅涉及遺傳病、傳染性疾病、腫瘤，還包括器官移植、老年性癡呆(AD)、動(dòng)脈粥樣硬化等領(lǐng)域。4轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在中醫(yī)藥動(dòng)物模型應(yīng)用的可能
　　從上個(gè)世紀(jì)60年代的40多年來(lái)中醫(yī)藥動(dòng)物模型研究雖已取得一些進(jìn)展和成果，但仍是制約中醫(yī)藥發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。目前制作中醫(yī)藥動(dòng)物模型的方法有病因模型、病理模型、證病結(jié)合模型。同時(shí)也存在著病因模型的不確定性、傳統(tǒng)病因模型忽視了人與動(dòng)物之間的差異、同證候模型間缺乏比較研究等問(wèn)題。HGP研究的方法學(xué)和中醫(yī)的整體觀、辯證觀有許多相似之處。在微觀水平的基因調(diào)控與修飾，反應(yīng)生命機(jī)體的整體機(jī)能狀態(tài)，基因組的多樣性決定了個(gè)體的特異性。如能將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物運(yùn)用于中醫(yī)藥動(dòng)物模型的構(gòu)建上，那無(wú)疑對(duì)中醫(yī)藥的發(fā)展和HGP的研究都是雙利的。
　　
　　5總結(jié)
　　
　　總之，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型具有能在整體水平從時(shí)間和空間四維角度同時(shí)觀察基因表達(dá)功能和表型效應(yīng)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。尤其在HGP不斷取得成果的背景下，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物人類疾病動(dòng)物模型能從基因水平上研究健康或疾病狀態(tài)的生物體生理和病理。同時(shí)若HGP不采用與人類疾病同源模型，其計(jì)劃就不能圓滿完