超聲波輔助提取石榴根皮總黃酮及其抑制亞硝化反應(yīng)活性

王占一,畢海丹,王玉海,鄭丹丹,戴 博,李卓瓦

(1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東棗莊 277160;2.空軍總醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100142)

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科石榴屬木本植物,資源分布極其廣泛,我國(guó)南北各省均有栽培[1]。石榴的藥用和食用部位主要為其果實(shí)部分,而自然淘汰的老根或作為石榴盆景淘汰的老樁經(jīng)常作為廢物被丟棄,造成資源浪費(fèi)。梁代陶弘景在《本草經(jīng)集注》中記載,石榴根皮具有殺蟲、澀腸、止帶等功效,是古代一種常用的中藥材。近年來,大量研究證明黃酮類成分廣泛存在于木本植物的根皮中,目前,研究較多的為菠蘿蜜[2]、白簕[3]、梓樹[4]等,而石榴根皮中是否含有黃酮類成分,國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。羅麗等[56]研究發(fā)現(xiàn),采用超聲波輔助提取植物藥材中的活性成分,具有條件溫和、環(huán)境友好、可操作性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn),使提取過程能夠在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)完成,有效避免了活性成分被氧化而喪失其功效,并提高了提取效率。但是,采用超聲波輔助提取石榴根皮中黃酮類成分的研究,國(guó)內(nèi)還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

癌癥是當(dāng)前威脅人類生活的最大殺手,根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界每年約有500萬人被癌癥奪取生命。在眾多致癌物中,亞硝胺是最令人關(guān)注的一類化學(xué)致癌物,因此,抑制亞硝化反應(yīng)的研究直接關(guān)系人體健康[7]。從防癌抗癌角度考慮,可以采取清除亞硝胺的合成前體亞硝酸鹽、阻斷亞硝胺的合成反應(yīng)來達(dá)到防癌目的[89]。天然植物中的黃酮類物質(zhì)對(duì)亞硝化反應(yīng)具有較強(qiáng)的抑制作用,國(guó)內(nèi)學(xué)者在這方面研究較多,例如,葉敏等[10]測(cè)定了響鈴草總黃酮體外清除亞硝酸鹽能力和阻斷亞硝胺合成能力;王曉波等[11]測(cè)定了雞骨草總黃酮體外抑制亞硝化反應(yīng)活性,均取得了較好的陽性結(jié)果。因此,本研究以石榴根皮為材料,采用超聲波輔助提取材料中總黃酮,并測(cè)定純化后的產(chǎn)物對(duì)亞硝酸鹽的清除能力和對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力,為石榴根皮總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn),促進(jìn)石榴資源的充分開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴根皮 采自山東嶧城“萬畝石榴園”核心產(chǎn)區(qū),經(jīng)棗莊學(xué)院閆志佩教授鑒定為正品石榴根皮,在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃干燥后,粉碎并過40目篩,備用;蘆丁對(duì)照品 純度>98%,批號(hào):100080-201202,中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;無水乙醇、碳酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、亞硝酸鹽、檸檬酸、磷酸氫二鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸苯乙二胺、a萘胺、二甲胺 均為分析純,天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;蒸餾水 棗莊學(xué)院生物學(xué)省級(jí)教學(xué)示范中心提供。

HNCQY型低溫超聲波萃取儀 上海汗諾儀器有限公司;MP502B型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;756型紫外可見分光光度計(jì) 上海光學(xué)儀器一廠;FW135型多功能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;RE2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;RV5型真空泵 英國(guó)Edwards公司;HHS2型電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;DGH9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 參照文獻(xiàn)[12]的方法,略有改動(dòng)。精密稱取蘆丁對(duì)照品12.5 mg置于小燒杯中,用75%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移定容至25 mL容量瓶中,即得500 μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞比色管中,加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,加入4% NaOH溶液5 mL,混勻,用75%乙醇定容至10 mL后靜置20 min,在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A值),并以A值為縱坐標(biāo),蘆丁系列濃度為橫坐標(biāo),得回歸方程A=0.6254C+0.0116(r=0. 9995),質(zhì)量濃度在0～60 μg/mL范圍內(nèi)與A值之間線性關(guān)系良好。

1.2.2 石榴根皮中總黃酮的制備與含量測(cè)定 精確稱取干燥后石榴根皮粉末5 g,按照規(guī)定的料液比加入設(shè)定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,置于低溫超聲波萃取儀中,設(shè)定超聲功率,提取至設(shè)定的反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后,3000 r/min離心30 min,分離所得上清液,回收乙醇溶劑,干膏至于小燒杯中,用75%乙醇溶解并定容至100 mL,作為樣品溶液。取樣品溶液適量用D101大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附,抽濾,用75%乙醇洗脫后,抽濾,濾液減壓蒸干后得到石榴根皮總黃酮固形物,稱重,備用。

準(zhǔn)確稱取精制后的石榴根皮總黃酮固形物2.0 mg,至于小燒杯中,用75%乙醇定容至100 mL,作為樣品溶液,按照“1.2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定A值,計(jì)算樣品中總黃酮得率及純度,并用于抑制亞硝化反應(yīng)活性研究。

式(1)

式(2)

1.2.3 石榴根皮總黃酮提取工藝實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)中,固定條件為:料液比1∶20 g/mL、超聲功率250 W、超聲時(shí)間35 min,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)石榴根皮總黃酮得率的影響;固定條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率250 W、超聲時(shí)間35 min,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)石榴根皮總黃酮得率的影響;固定條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲時(shí)間35 min,考察超聲功率(150、200、250、300、350 W)對(duì)石榴根皮總黃酮得率的影響;固定條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲功率250 W,考察超聲時(shí)間(25、30、35、40、45 min)對(duì)石榴根皮總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 BoxBehnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用BoxBehnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以石榴根皮總黃酮得率(Y)為響應(yīng)值,選取單因素實(shí)驗(yàn)中的4個(gè)因素,建立四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)平行3次,取平均值。因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Level and factors of response surface experimental design

1.2.4 石榴根皮總黃酮抑制亞硝化反應(yīng)

1.2.4.1 石榴根皮總黃酮對(duì)亞硝酸鹽清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[10]的方法,略有改動(dòng)。分別吸取1.2.2項(xiàng)下樣品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL于12支25 mL具塞比色管中,依次加入50 μg/mL的NaNO2溶液1.0 mL,pH3.0的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液(15.254 g檸檬酸、5.836 g磷酸氫二鈉定容至1000 mL)10.0 mL,于37 ℃水浴鍋中保溫1 h,取出后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的對(duì)氨基苯磺酸2.0 mL,搖勻后靜置5 min,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的鹽酸萘乙二胺1.0 mL,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻后靜置15 min。以VC作對(duì)照,用分光光度計(jì)在確定最大吸收波長(zhǎng)λmax=540 nm處測(cè)定吸光度,并按照下式計(jì)算亞硝酸鹽清除率:

式(3)

式中:A0為未加樣品溶液時(shí)NaNO2溶液的吸光度(以試劑作空白對(duì)照);A為加入樣品溶液時(shí)NaNO2溶液的吸光度。

1.2.4.2 石榴根皮總黃酮對(duì)亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[13]的方法,略有改動(dòng)。分別吸取1.2.2項(xiàng)下樣品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL于12支25 mL比色管中,依次加入pH3.0的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液10.0 mL,69.5 μg/mL的NaNO2溶液1.0 mL,45.08 μg/mL的二甲胺溶液1.0 mL,用蒸餾水稀釋至刻度,于37 ℃水浴鍋中保溫1 h。準(zhǔn)確吸取1.0 mL加入到7 cm2的培養(yǎng)皿中,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的Na2CO3溶液0.5 mL,于紫外分析儀(λ=254 nm)上輻照15 min。取出后依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的對(duì)氨基苯磺酸1.5 mL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的α萘胺1.5 mL,蒸餾水0.5 mL,搖勻后靜置15 min。以VC作對(duì)照,用分光光度計(jì)在確定最大吸收波長(zhǎng)λmax=525 nm處測(cè)定吸光度,并按照下式計(jì)算對(duì)亞硝胺合成的阻斷率:

式(4)

式中:A0為未加樣品溶液時(shí)NaNO2溶液的吸光度(以試劑作空白對(duì)照);A為加入樣品溶液時(shí)NaNO2溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用DesignExpert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件,數(shù)據(jù)分析處理采用SPSS 20.0和Microsoft excel 2010軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴根皮總黃酮的提取工藝參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響 如圖1所示,乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%范圍內(nèi),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,總黃酮得率有明顯提高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),總黃酮得率達(dá)到最大值。此后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,總黃酮得率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。根據(jù)“相似者相溶”原理,體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液和材料中總黃酮極性相似,因此,總黃酮得率較高,而提取溶液高于或低于這個(gè)極性,總黃酮得率相應(yīng)降低,因此,確定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%左右。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 如圖2所示,料液比在1∶10～1∶20 g/mL范圍內(nèi),隨著溶劑用量的增大,總黃酮得率有明顯的提高,當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時(shí),總黃酮得率達(dá)到2.35%。此后繼續(xù)增大料液比對(duì)總黃酮得率的影響不大,甚至出現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因是原料質(zhì)量一定,增大溶劑用量,會(huì)提高總黃酮得率,但是,當(dāng)料液比例達(dá)到一定值后,材料中的總黃酮基本提取完全,故再增加料液比例,總黃酮得率不再提高,基于經(jīng)濟(jì)方面考慮,確定料液比1∶20 g/mL左右為宜。

圖2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1.3 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響 如圖2所示,超聲功率在150～250 W范圍內(nèi),隨著超聲功率的增大,總黃酮得率有明顯的提高,當(dāng)超聲功率為250 W時(shí),總黃酮得率達(dá)到2.33%。當(dāng)超聲功率超過250 W后,總黃酮得率隨超聲功率增加變化趨勢(shì)并不明顯。原因是超聲功率較低時(shí),空化泡的最大半徑與起始半徑的比值增大,空化強(qiáng)度增大,即聲強(qiáng)愈高,空化效應(yīng)愈強(qiáng)烈,有利于總黃酮成分的浸出;但是,當(dāng)超過一定值時(shí),聲強(qiáng)過高,會(huì)產(chǎn)生大量無用的氣泡,從而束縛了浸出效率的提高[6],從節(jié)約能源角度考慮,確定超聲功率為250 W左右。

圖3 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1.4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 如圖4所示,超聲時(shí)間在25～35 min范圍內(nèi),隨著超聲時(shí)間的增大,總黃酮得率有明顯的提高,當(dāng)超聲時(shí)間35 min時(shí),總黃酮得率達(dá)到2.34%。當(dāng)超聲時(shí)間超過35 min后,總黃酮得率隨超聲時(shí)間增加變化趨勢(shì)并不明顯。原因是黃酮類成分從固相向液相傳遞是一個(gè)復(fù)雜過程,故而延長(zhǎng)提取時(shí)間,總黃酮得率升高。但是,提取時(shí)間太長(zhǎng),原料與提取溶劑之間的濃度差變小;同時(shí),部分產(chǎn)物被分解而影響了提取效果,從而使得總黃酮得率升高趨勢(shì)緩慢。因此,確定超聲時(shí)間為35 min左右。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 BoxBehnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸模型的建立及方差分析 根據(jù)DesignExpert 8.0.5軟件中所提供的實(shí)驗(yàn)方案安排實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。(n=3)對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到各因素與響應(yīng)值之間的二次回歸方程為:

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Arrangement and corresponding results of BoxBehnken experimental design

Y=2.74+0.14X1+0.23X2+0.069X30.17X4-0.02X1X2+0.25X1X30.15X1X4+0.17X2X3-0.12X2X4+0.29X3X40.48X120.42X220.15X320.25X42

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.1.3 兩因素交互效應(yīng)分析 圖5為兩因素交互作用顯著的響應(yīng)面與等高線圖,響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度可以直觀反映各因素之間的交互作用對(duì)石榴根皮總黃酮的影響。等高線呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著[1617]。由圖5a可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化曲面比超聲功率的變化曲面陡峭,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)比超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響更顯著一些,與方差分析結(jié)果相符。同理,由圖5b和5c可知,兩兩因素交互作用時(shí),料液比和超聲時(shí)間均比超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響顯著,均與方差分析結(jié)果相符。圖5所示的等高線均呈明顯的橢圓形,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率、料液比和超聲功率及超聲功率與超聲時(shí)間之間交互作用均顯著,對(duì)總黃酮得率的影響較大。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots

2.1.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證 通過響應(yīng)面分析得到超聲波輔助提取石榴根皮總黃酮的最佳工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)62.8%,料液比1∶21.95 g/mL,超聲功率271.5 W,超聲時(shí)間33.75 min,在此條件下預(yù)測(cè)總黃酮得率為2.84%。實(shí)際操作中稍作調(diào)整確定的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63%,料液比1∶22 (g/mL)超聲功率270 W,超聲時(shí)間34 min。進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得總黃酮平均得率為2.81%,與理論值非常接近,誤差僅為1.06%。

2.2 石榴根皮總黃酮抑制亞硝化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用式(2)計(jì)算得出純化后的石榴根皮總黃酮固形物純度約為75%,進(jìn)而得出1.2.2項(xiàng)下,用于抑制亞硝化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的樣品溶液中總黃酮真實(shí)濃度為15 μg/mL。樣品溶液總黃酮對(duì)亞硝酸鹽清除率的測(cè)定結(jié)果見圖6,對(duì)亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定結(jié)果見圖7。

圖6 石榴根皮總黃酮及VC對(duì)亞硝酸鹽的清除率Fig.6 The sodium nitrite scavenging rates of total flavonoids from pomegranate root bark and VC

圖7 石榴根皮總黃酮及VC對(duì)亞硝胺合成的阻斷率Fig.7 The nitrosamine synthesis inhibiting rates of total flavonoids from pomegranate root bark and VC

由圖7可知,在0.12～3.6 μg/mL范圍內(nèi),隨著濃度的增加,石榴根皮總黃酮對(duì)亞硝酸胺合成的阻斷率明顯增加,當(dāng)濃度為3.6 μg/mL時(shí),阻斷率達(dá)到71.9%。石榴根皮總黃酮濃度與對(duì)亞硝酸胺合成的阻斷率之間存在著正相關(guān)關(guān)系,擬合方程為y=16.48x+11.35,決定系數(shù)R2=0.990。通過擬合方程算出石榴根皮總黃酮對(duì)亞硝酸胺合成的阻斷作用的IC50=2.345 μg/mL。同理,VC對(duì)亞硝酸鹽清除作用的IC50=1.087 μg/mL,石榴根皮總黃酮對(duì)亞硝酸胺合成的阻斷作用低于VC。已有學(xué)者研究表明,木蝴蝶總黃酮等酚類成分具有較強(qiáng)清除亞硝酸鹽和抑制亞硝胺合成能力,且清除(抑制)作用與植物酚類化合物的含量密切相關(guān)[1921],這與本研究的結(jié)果一致。黃酮類化合物是一類多羥基酚類化合物,酚羥基極易發(fā)生氧化、縮合、聚合等變化,所以具有較強(qiáng)的抗氧化能力[22]。亞硝酸鹽是一種氧化劑,黃酮類成分能與亞硝酸根通過氧化還原反應(yīng)而清除亞硝酸鹽,并抑制亞硝胺的合成數(shù)量[23]。

3 結(jié)論

本文以石榴根皮為研究對(duì)象,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用BoxBehnken Design(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以總黃酮得率為考察指標(biāo),優(yōu)選出超聲波提取石榴根皮總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63%,料液比1∶22 g/mL,超聲功率270 W和超聲時(shí)間34 min,在此條件下石榴根皮總黃酮得率為2.81%,與模型預(yù)測(cè)值接近。石榴根皮總黃酮具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽能力和抑制亞硝胺合成能力,質(zhì)量濃度為3.6 μg/mL時(shí),對(duì)亞硝酸鹽的最大清除率為64.5%,清除作用的IC50=2.408 μg/mL,對(duì)亞硝胺合成的最大阻斷率為71.9%,阻斷作用的IC50=2.345 μg/mL,在質(zhì)量濃度0.12～3.6 μg/mL范圍內(nèi),石榴根皮總黃酮與對(duì)亞硝酸鹽清除效果和抑制亞硝酸胺合成效果之間均呈一定的正相關(guān)關(guān)系。

[1]汪小飛,周耘峰,黃埔,等. 石榴品種數(shù)量分類研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,52(5):10931098.

[2]李海濱,胡曉旭,普開,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化野菠蘿蜜根皮總黃酮的微波提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(6):226229.

[3]蔡凌云,黎元祥,陳蕉,等. 白簕根皮總黃酮提取工藝研究[J]. 食品科學(xué),2009,30(4):1518.

[4]邵金華,何福林,陳霞,等. 梓樹根皮總黃酮分離純化及其抑菌活性研究[J]. 食品與機(jī)械,2017,33(2):140144.

[5]羅麗,梁琪,張炎,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取沙棗果總黃酮工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(5):269274.

[6]Pan G Y,Yu G Y,Zhu C H,et al. Optimization of ultrasoundassisted extraction(UAE)of flavonoids compounds(FC)from hawthorn seed(HS)[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2012,19(3):486490.

[7]Lei Y,Chen Z L,Shen J M,et al. Reinvestigation of the nitrosamine formation mechanism during ozonation[J]. Environmental Science & Technology,2009,43(14):54815487.

[8]黃高凌,翁聰澤,倪輝,等. 琯溪蜜柚果皮提取物抑制亞硝化反應(yīng)的研究[J]. 食品科學(xué),2007,28(12):3639.

[9]Sun Y C,Mi J C,Lee J H,et al. Nnitrosamine inhibition by strawberry,garlic,kale,and the effects of nitritescavenging and Nnitrosamine formation by functional compounds in strawberry and garlic[J]. Food Control,2007,18(5):485491.

[10]葉敏,邵艷萍. 響鈴草總黃酮清除自由基及抑制亞硝化作用的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(5):667671.

[11]王曉波,黃疊玲,劉冬英,等. 雞骨草總黃酮清除自由基及抑制亞硝化作用研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(4):942944.

[12]岳秀杰,李超,扶雄. 超聲提取辣木葉黃酮優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(1):226231.

[13]馮紀(jì)南,黃海英,余瑞金,等. 柑橘皮黃酮提取工藝及抑制亞硝化反應(yīng)[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室,2013,30(5):23722378.

[14]郭慶啟,黃麗洋,王振宇,等. BoxBehnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化微波輔助提取大豆胚芽黃酮的工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(2):214216.

[15]陳貴堂,趙立艷,劉瑞,等. 響應(yīng)面優(yōu)化酶法輔助提取金針菇根部多糖的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(24):209213.

[16]豆亞靜,張曉龍,常立新,等. 響應(yīng)面優(yōu)化超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(5):259263.

[17]常立新,賈長(zhǎng)虹,郁春樂. 響應(yīng)面優(yōu)化玉米芯黃酮的提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(2):259263.

[18]樊倩,韋慶益,袁爾東,等. 植物中絡(luò)氨酸酶的篩選及不同抑制劑對(duì)其活性的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(10):9193.

[19]劉可心,蘭永強(qiáng),楊娜,等. 木蝴蝶總黃酮的提取及體外清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,30(6):669674.

[20]Lu M J,Chen C. Enzymatic tannase treatment of green tea increasesinvitro,inhibitory activity against Nnitrosation of dimethylamine[J]. Process Biochemistry,2007,42(9):12851290.

[21]郭琦,高春燕. 地參酚類化合物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用[J]. 食品工業(yè)科技,2017,38(19):5761.

[22]劉智峰. 酶法超聲波輔助提取香椿葉中總黃酮及抗氧化性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(20):314319.

[23]Liu J,Lin S,Wang Z,et al. Supercritical fluid extraction of flavonoids from Maydis stigma and its nitritescavenging ability[J].Food & Bioproducts Processing,2011,89(4):333339.