紫云英根瘤菌劑的應(yīng)用與生產(chǎn)方法

陳逸湘　李　忠

摘要 闡述紫云英根瘤菌劑的應(yīng)用，并從根瘤菌的分離、根瘤菌的鑒定、斜面菌種培養(yǎng)、液體菌種培養(yǎng)、泥炭土的加工處理、成品制備等方面介紹紫云英根瘤菌劑的生產(chǎn)方法，以期為生產(chǎn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的紫云英綠肥與飼料作物提供參考。

關(guān)鍵詞 紫云英；根瘤菌劑；應(yīng)用；生產(chǎn)

1紫云英根瘤菌劑的應(yīng)用

為提高農(nóng)田利用率，增加有機(jī)肥效，解決雙季稻田肥料問題，促進(jìn)作物快速生長，種植紫云英綠肥是簡易有效的好辦法。稻田冬種紫云英可節(jié)省后作肥料用量，提高其產(chǎn)量。試驗證明：每壓青2 000kg紫云英鮮草，可少施尿素10～12kg，增加稻谷375～600 kg/hm²，同時還能增加土壤養(yǎng)分含量，提高土壤肥力。紫云英除用作綠肥外，還能直接或青貯紫云英作飼料。其幼苗還是一種美味的蔬菜。

紫云英通常是在每年9～10月播種，根瘤菌肥料就是在播種時拌種使用的。頭一、二年種綠肥，采用紫云英根瘤菌劑接種，能增產(chǎn)20％～30％，效果很顯著。接種紫云英根瘤菌，是種植紫云英成敗和提高鮮草產(chǎn)量的關(guān)鍵措施。紫云英根瘤菌與紫云英共生，才能固定空氣中的氮素，促進(jìn)植株生長。因此，使用紫云英根瘤菌，特別在首次種植紫云英綠肥的地區(qū)，對于提高紫云英綠肥的產(chǎn)量有很大作用。

2紫云英根瘤菌劑的生產(chǎn)方法

2.1根瘤菌的分離

從生長狀態(tài)良好的紫云英菌株根部選擇肥大、飽滿、粉紅色的根瘤，用水沖洗干凈，然后用無菌水沖洗，濾紙洗干后，用75％乙醇浸泡2min，用0.1％氯化汞浸泡2～5min，用無菌水沖洗5～6次，在無菌條件下，用鑷子將根瘤壓碎。將擠出液接種到斜面試管內(nèi)，28℃培養(yǎng)，長出菌落之后，進(jìn)行平板稀釋分離，將單菌落接到斜面上。重復(fù)進(jìn)行稀釋分離，獲得單菌落接種到斜面上保存。此為初步分離的根瘤菌菌株。

斜面培養(yǎng)基配方：蔗糖1％＋K2HPO40.05％＋MgSO4 0.02 ％＋NaCl 0.02％＋CaCO30.3％＋酵母粉0.50％＋微量元素液0.4％＋瓊脂2％，pH值7.0。

微量元素液配方：Na2MoO4·2H2O 0.5%+HBO30.5％。

2.2根瘤菌的鑒定

2.2.1純度檢查。觀察菌落是否圓形、邊緣整齊、稍突起，在含有剛果紅的甘露醇-酵母培養(yǎng)基平板上呈乳白色或無色半透明。革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察是否為短桿狀、無芽胞的革蘭氏陰性菌。

2.2.2回接實驗。將紫云英種子用75％乙醇浸泡5min，再用0.1％HgCl2浸泡5min，然后用無菌水沖洗4～6次，用濾紙洗干。將消毒過的種子放在滅菌濕濾紙片上，置25～30℃中催芽。把分離到的紫云英根瘤菌在無菌條件下接種到發(fā)芽的紫云英種子上，在無氮培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每天光照12h，日夜溫差5～10℃，保持空氣相對濕度在50％～70％。與無接種的植株對比，回接所用的根瘤菌對其寄主紫云英全部結(jié)瘤，結(jié)瘤固氮性能優(yōu)良，接種植株干重比對照顯著增加。 則可證明供試根瘤菌是紫云英的共生根瘤菌，可用于生產(chǎn)。

2.3斜面菌種培養(yǎng)

將配好的培養(yǎng)基裝入克氏瓶中，塞上棉塞，滅菌30min，趁熱擺斜面，冷卻后接種。在超凈臺上酒精燈的火焰旁，用接種針挑取原種少許，在斜面上劃“之”形，塞上棉塞。置25～28℃下培養(yǎng)3～4d。觀察到斜面菌苔豐滿，表面濕潤光滑，呈粘液狀，無色透明或乳白色，無氣味，則為正常，可用于進(jìn)一步生產(chǎn)。

2.4液體菌種培養(yǎng)

配好液體培養(yǎng)基，裝入大三角瓶中，每瓶600mL，高壓滅菌。冷卻后接種。在超凈臺上酒精燈火焰旁，將無菌水倒入克氏瓶中，再用灼燒過的接種環(huán)，把根瘤菌的菌苔從斜面上刮下，輕輕攪拌，成為懸浮液，很快倒入三角瓶中的液體培養(yǎng)基內(nèi)，包扎好瓶口。在25～28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)3～4d。觀察到菌液濃稠，聞之有醇香的氣味，則可用于拌土生產(chǎn)。

液體培養(yǎng)基配方：蔗糖1％＋K2HPO40.05％＋MgSO40.02％＋NaCl0.02％＋CaCO30.3％＋酵母粉0.50％＋微量元素液0.4％＋豆芽20％+瓊脂2％，pH值7.0（先將豆芽放入水中熬煮出汁，去渣后加入其他配料）。

2.5泥炭土的加工處理

根瘤菌一般適宜于濕潤、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣良好的土壤中，泥炭土含有根瘤菌必需的養(yǎng)分，同時泥炭的保水力強，質(zhì)地疏松，不粘結(jié)成塊，通氣良好，是一種理想的培養(yǎng)基。但是，有時泥炭土過于潮濕，并且含有霉菌，不經(jīng)加工處理不能直接利用。所以要曬、磨、篩，再經(jīng)過高溫消毒滅菌，才能達(dá)到拌種均勻、根瘤菌再繁殖的目的。

2.6成品制備

測定泥炭土的含水量，然后按每千克泥炭土拌加40mL菌液拌合，動作要輕快，拌合要均勻。拌菌后的泥炭土濕度要求達(dá)到35％左右，然后將成品裝入密封袋。

3紫云英根瘤菌劑施用方法

按500g菌劑可用0.27hm²種子量拌種。將菌劑在清潔地板或容器內(nèi)，加入適量清潔水，調(diào)成糊狀，把紫云英種子放入拌勻，稍等晾干，即行播種。注意菌劑應(yīng)存放在陰涼清潔的地方，當(dāng)天拌種，當(dāng)天播完，切忌與農(nóng)藥混用。