高眼壓動物模型的研究進展

劉科琳 王英 李君一 徐韶琳

(吉林大學第二醫(yī)院眼科中心青光眼科 長春 130041)

青光眼是一組威脅和損害視神經(jīng)及視覺通路，導致視覺功能損害的疾病，病變造成的進行性視神經(jīng)萎縮不可逆轉(zhuǎn)，給患者生活質(zhì)量造成很大影響。對于40~80歲的人群，青光眼的全球患病率為3.54%[1]；在亞洲，原發(fā)性閉角型青光眼患病率最高，達1.09%[2]，致盲率達10%。其發(fā)病機制尚未闡明，眼壓升高是其危險因素。在研究青光眼的損傷機制和發(fā)展過程中，實驗動物模型的建立必不可少。目前比較常用的動物有兔、猴、鼠等，猴眼與兔眼二者體積相對較大，操作容易，易于在實驗中觀察眼底；但是成本高，猴更是價格昂貴，而兔常出現(xiàn)眼內(nèi)炎癥，對實驗研究皆是一種限制[3]。嚙齒動物鼠模型是優(yōu)選的模型之一，因為鼠的壽命較短且成本較低；此外嚙齒類動物在與人的眼部解剖結(jié)構(gòu)上有許多相似之處，比如有類似的小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)、發(fā)達的睫狀肌以及類似的房水流出途徑和房水動力學[4]；并且嚙齒類動物高眼壓模型的表現(xiàn)與人類青光眼疾病特征具有一定的相似性，如高眼壓所導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglial cell，RGC)和視神經(jīng)的損害[5]。本文就青光眼高眼壓模型的發(fā)展做一概括，從操作誘導模型和轉(zhuǎn)基因模型2個方面對國內(nèi)外學者研究的常用青光眼高眼壓模型進行總結(jié)，分析其利弊，為以后研究選擇實驗動物模型提供參考和依據(jù)。

1 操作誘導模型

現(xiàn)有高眼壓模型的建立多以阻滯房水循環(huán)為基礎(chǔ)達到增高眼壓的目的，通過影響小梁網(wǎng)組織或改變鞏膜上靜脈壓力進而影響房水流出途徑。常見操作誘導法分為前房阻塞法、藥物誘導法及機械損傷法。

1.1 前房阻塞法

1.1.1 自體血細胞前房阻塞法 1980年報道記錄Quigley和Addicks使用自體固定紅細胞建立實驗靈長類動物慢性眼壓升高模型。該模型通過裂解離心等一系列操作溶出新鮮血細胞中的血紅蛋白，形成固定的血影細胞(ghost blood cell，GBC)。這種失去了大部分或全部血紅蛋白的GBC，殘留的包膜較硬，進入前房后，難以離開小梁網(wǎng)孔，進而阻塞小梁網(wǎng)影響房水循環(huán)引起高眼壓。鏡下顯示，小梁網(wǎng)內(nèi)有大量的變形GBC。該模型的優(yōu)點是容易產(chǎn)生眼壓升高，并且少有相關(guān)的眼內(nèi)炎癥，而為使眼壓增高，需要廣泛大量填充前房，導致模型具有眼底視盤可視度差的缺點[6]。

1.1.2 微珠前房阻塞法 小梁網(wǎng)細胞是活躍的吞噬細胞，其功能可能是使引流途徑不受細胞碎片、色素和其他物質(zhì)的影響。微珠注入眼前段，部分可被小梁網(wǎng)細胞吞噬，阻礙房水的流出[7]。隨著研究的深入，微珠注射開始應用于高眼壓模型制備。2001年Weber等[8]報道一種靈長類動物實驗性青光眼模型，通過向雌性恒河猴的眼前房注射直徑10 μm無菌乳膠微珠，誘導非人靈長類動物眼內(nèi)壓升高模型。乳膠微珠主要通過限制房水通過小梁網(wǎng)流出來產(chǎn)生高眼壓，操作過程無須昂貴的眼科設(shè)備和人員及手術(shù)干預。乳膠微珠阻塞相對于自體血細胞注射而言，提高了視盤的可見性。考慮到體外異物會引起眼內(nèi)炎癥問題，乳膠微珠常通過γ輻射進行徹底清洗滅菌[9]。但是微珠小梁網(wǎng)阻塞法依然具有局限性，微珠眼前段注射后可能難以長久保留，從而導致眼壓的變化增大，珠子在前房內(nèi)的位置也無法很好控制。如果微珠懸浮于瞳孔區(qū)域，它們依舊會影響檢眼鏡觀察眼底的視野。后續(xù)此類模型不斷改進，Samsel等[10]提出了一種利用磁性微珠誘導高眼壓的新技術(shù)。磁珠的優(yōu)點是通過使用磁性微珠和手持磁鐵，可以降低注射后的磁珠回流并改善前房中的磁珠分布，將它們注入嚙齒動物眼中的虹膜角膜角，增強小梁網(wǎng)的閉塞并促進眼底的可視化?？梢愿鶕?jù)需要進行后續(xù)注射，以進一步調(diào)節(jié)眼壓的升高，為實驗性青光眼的誘導提供了一種簡單、有效的方法。也有研究[11]將微珠與黏彈性溶液混合注入前房，此種模型相對于單純注射微珠可以建立實現(xiàn)更持久的眼壓升高。2019年Biswas等[4]總結(jié)了前人所做的在重復注射或不重復注射的情況下，在大鼠和小鼠身上使用不同尺寸、體積和濃度的微珠來建立青光眼模型?？傊?，微珠前房阻塞法具有方法簡單，實驗動物易耐受的優(yōu)點，但微球可能阻塞瞳孔影響進一步觀察是其劣勢[12]。

1.1.3 凝膠前房阻塞法 有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)兔、猴和人眼中具有糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)譜，即透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、硫酸角質(zhì)素(keratan surfate，KS)、硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素-硫酸軟骨素雜化，特別是小梁GAG與流出阻力的調(diào)節(jié)以及青光眼的發(fā)展有關(guān)。人眼小梁網(wǎng)中GAG的強烈組織化學染色表明，在流出途徑中存在大量的HA[15]，定量分析表明它是人眼小梁網(wǎng)中含量最豐富的GAG[14]。Benozzi等[16]通過向大鼠前房注射HA肯定了其對眼壓的影響，但并未解決是否存在視神經(jīng)及視網(wǎng)膜病變。后Moreno等[17]通過建立同樣模型對比發(fā)現(xiàn)，實驗引起的視網(wǎng)膜改變與其他青光眼實驗模型中觀察到的變化類似，提出HA前房注射可能是一種新的大鼠青光眼高眼壓模型。近些年提出幾種HA為骨架的改良生物基質(zhì)[18-19]制備高眼壓模型，與HA相比具有一定優(yōu)化性。2002年徐巖等[20]首次報道了以復方卡波姆為誘發(fā)高眼壓模型材料的研究,肯定了該模型的可行性與實用性。之后，應用此種高眼壓模型進行青光眼相關(guān)病理的研究逐漸增多。凝膠前房阻塞法既有優(yōu)越性又有不足，凝膠成本較低，操作方便，無須精細技術(shù)；但復方卡波姆pH較低值，可能會引起炎癥反應。

1.2 前房灌注法 前房生理鹽水灌注法是通過將輸液針頭連接到無菌生理鹽水瓶上，然后將針頭刺入實驗動物前房，將輸液瓶提升至高于眼睛水平面150 cm的高度，這一高度可以使實驗動物眼壓升高至110 mmHg(1mmHg=0.133kPa)，是一種常見的急性高眼壓模型建造方法，解剖上觀察可發(fā)現(xiàn)急性高眼壓引起的軸突變性、RGCs明顯丟失等一系列典型表現(xiàn)[21]。此模型病理生理上也稱為缺血-再灌注損傷模型，具有操作方便，眼壓升高幅度可控的優(yōu)點，可以通過調(diào)整灌注液的高度準確制作出不同病變損傷程度的缺血模型。該方法可適用于鼠、兔等多種實驗動物用來制作穩(wěn)定、易得的急性高眼壓動物模型[22]。

1.3 藥物誘導法 糖皮質(zhì)激素(簡稱激素)誘導法。全身或局部應用激素在一定程度上抑制人眼小梁網(wǎng)細胞吞噬作用，增加房水流出阻力，升高眼內(nèi)壓，導致繼發(fā)性青光眼[23]。激素可以調(diào)節(jié)各種細胞外基質(zhì)(etracellular matrix，ECM)蛋白的表達和分泌，暴露于地塞米松的人小梁網(wǎng)細胞顯示層粘連蛋白、纖連蛋白等蛋白表達增加，這些蛋白可能會聚集在小梁網(wǎng)中，進而阻止房水流出。地塞米松還可能影響調(diào)節(jié)ECM轉(zhuǎn)換蛋白水解酶的表達，包括基質(zhì)金屬蛋白酶和組織纖溶酶原激活劑，導致小梁網(wǎng)組織中ECM物質(zhì)的堆積，進而房水流出阻力增加，眼壓升高[24]。激素誘發(fā)高眼壓已經(jīng)在多種實驗動物模型中得到證實[25-28]。2014年Zode等[29]通過小鼠局部眼睛滴用地塞米松誘導高眼壓小鼠模型，觀察到慢性地塞米松治療導致小鼠RCG結(jié)構(gòu)和功能喪失以及視神經(jīng)變性，與激素誘發(fā)的青光眼患者相似。除上述的外用眼部滴用激素，也有研究[30]選擇全身應用激素檢測眼壓變化，但是全身應用激素的影響，使得一些實驗動物無法存活。此類模型操作簡單，具有很大的潛在價值，但是容易引起激素并發(fā)癥，建造此類青光眼模型時，實驗動物的選擇比較重要。

1.4 機械損傷法

1.4.1 鞏膜外靜脈烙閉或結(jié)扎法 鞏膜上靜脈燒灼術(shù)(episcleral vein cauterization，EVC)又稱Shareef模型，是目前青光眼模型中比較成熟、使用較多的一種。Shareef等[31]以大鼠為實驗動物，通過燒灼烙閉2條或以上鞏膜上靜脈影響房水流出來模擬青光眼高眼壓模型，燒灼后觀察可見鞏膜上靜脈立即充血，眼壓明顯升高，并能維持較長時間。病變特點與臨床開角型青光眼相似[32]。模型不斷被發(fā)展，豬[33]、兔[34]也成為此種模型的實驗對象?？紤]到鞏膜上靜脈燒灼具有一定難度，可能會對鞏膜造成損害，Yu等[35]以大鼠為實驗動物，通過鞏膜上靜脈結(jié)扎術(shù)，建立同樣阻塞鞏膜上靜脈血流，達到眼壓升高、視網(wǎng)膜視神經(jīng)病變?yōu)槟康牡那喙庋鄹哐蹓耗Ｐ汀Ｆ淙秉c在于即使非常小心地避免鞏膜受損，燒灼手術(shù)有時也會對周圍的眼睛組織或鞏膜造成傷害，并伴有諸如眼內(nèi)炎癥或眼表損傷之類的眼部并發(fā)癥[36]。

1.4.2 激光光凝法 1974年首次報告一種以恒河猴為實驗對象的高眼壓模型，該模型通過氬激光光凝恒河猴前房角小梁網(wǎng)，造成房水流出能力降低，從而形成高眼壓，觀察發(fā)現(xiàn)小梁及其周圍組織瘢痕形成伴Schlemm管閉塞[37]。之后也出現(xiàn)以同樣方法制備兔青光眼高眼壓模型的研究[38]。此類模型在當時條件的限制下，對于體型較小的嚙齒類動物，常因前房角太窄等原因致使光凝時無法精確對準小梁網(wǎng)。日本學者[39]設(shè)計研究一種通過激光光凝選擇性燃燒嚙齒動物小梁網(wǎng)的方法，以大鼠為實驗模型，通過前房注射印度墨汁，3~7 d后，房水循環(huán)可將碳顆粒沉積在小梁網(wǎng)中，沿角膜緣形成約0.2 mm寬的黑帶，為后續(xù)激光光凝小梁網(wǎng)提供直觀的操作部位，也因此成功建立了激光技術(shù)嚙齒類動物青光眼高眼壓模型。之后也有研究[40]通過前房注射吲哚菁綠染料和半導體激光聯(lián)合治療，證實激光燒灼吲哚菁綠預處理眼是一種成功誘導小鼠慢性高眼壓模型的方法。激光光凝小梁網(wǎng)建立實驗動物高眼壓模型從嘗試到改進發(fā)展，其操作技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟。激光光凝是一種完全非侵入性建模方法，實驗動物眼壓升高迅速并且維持時間長，但是所需設(shè)備昂貴，操作相對復雜，激光對小梁網(wǎng)的破壞較徹底并且不可逆，實驗中可能會出現(xiàn)眼壓不穩(wěn)定或不可逆瞳孔散大等問題[12]。

2 基因誘導模型

遺傳學研究一直是了解導致疾病或改變疾病易感性的基因和病理機制的有力手段。近些年，青光眼的分子基礎(chǔ)取得重要進展，人類基因研究的證據(jù)表明，MYOC中的顯性遺傳突變會導致原發(fā)性開角型青光眼[41]。1998年有研究記錄DBA/2J品系小鼠眼前段異常的發(fā)展，最早在3~4個月可發(fā)現(xiàn)小鼠眼周邊虹膜透光性缺陷、色素彌散以及瞳孔邊緣因局部聚集充滿色素的巨噬細胞而導致的虹膜增厚，并隨著時間的推移變得更加嚴重。這些異常導致眼壓升高繼而形成人類所謂的青光眼，病理變化過程中伴隨著與青光眼相一致的視網(wǎng)膜和視神經(jīng)改變，證實了使用該小鼠品系來評估影響青光眼細胞死亡的機制和確定改變青光眼神經(jīng)損傷易感性的基因是可行的[42]。后DBA/2J小鼠純系被用作慢性閉角型青光眼的嚙齒動物模型[43]。Anderson等[44]在報道中描述了AKXD28小鼠品系，AKXD28是由DBA/2J和AKR/J品系小鼠雜交產(chǎn)生的重組近交系，研究顯示AKXD28小鼠患上與年齡相關(guān)的青光眼，包括眼壓升高和視神經(jīng)損傷表現(xiàn)；更重要的是，雖然DBA/2J和AKXD28品系小鼠實驗中表現(xiàn)出相似程度的眼壓，但AKXD28小鼠的視網(wǎng)膜損傷比DBA/2J小鼠更嚴重、更廣泛，這表明與DBA/2J小鼠相比，AKXD28小鼠對壓力誘導的損傷具有更高的遺傳易感性。這2種品系小鼠均可作為慢性高眼壓模型使用。但尚無可用于急性和間歇性/亞急性閉角型青光眼的遺傳性動物模型，近些年Ittner等[45]首次提出一種新的轉(zhuǎn)基因小鼠高眼壓模型，與DBA/2J小鼠不同，報告提出的CLR轉(zhuǎn)基因小鼠在1~3個月時可出現(xiàn)急性眼壓增高，可作為一種新的自發(fā)性急性高眼壓模型。轉(zhuǎn)基因及基因打靶制備青光眼模型目前正在蓬勃發(fā)展中，無論是制備高眼壓模型或是非高眼壓模型，較多研究者已開始進行實驗，此類模型仍待更進一步探索與了解。

3 結(jié)語

青光眼模型的制備方法有很多，制備模型可選擇的實驗動物亦有多種。本文僅從高眼壓模型這一個角度描述了近些年常用的青光眼高眼壓模型的研究進展，無論是操作誘導模型還是轉(zhuǎn)基因模型都各有利弊，實驗者在具體研究中應根據(jù)實驗目的選擇合適的造模方法。傳統(tǒng)的誘導操作模型前人積累的經(jīng)驗較多，為后來的實驗進行提供更多的選擇；正在蓬勃發(fā)展、有待更深探索的轉(zhuǎn)基因模型雖然了解不夠全面，但是未來隨著對青光眼分子機制的了解，轉(zhuǎn)基因模型的制備具有很大的研究前景。