慢性鼻-鼻竇炎患者HIF-1α、FoxM1的表達(dá)及其與黏蛋白MUC5AC、MUC5B的相關(guān)性

唐進(jìn)渝 彭麗娟 鐘春燕 杜經(jīng)緯

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科,四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,四川 南充 637000)

慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是耳鼻咽喉科常見病,一般表現(xiàn)為鼻腔和鼻竇黏膜的慢性炎癥反應(yīng),粘液分泌過多影響患者的生活質(zhì)量[1]。CRS一般有兩種亞型:伴有鼻息肉的CRS(CRS with nasal polyps,CRS wNP)和不伴有鼻息肉的CRS(CRS without nasal polyps,CRS sNP)。關(guān)于本病的病理機(jī)制比較復(fù)雜,目前尚未完全闡明,普遍認(rèn)為多種炎癥模式與粘液纖毛和/或結(jié)構(gòu)異常共同作用,從而導(dǎo)致CRS的發(fā)展[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)CRS鼻竇黏膜上黏蛋白5AC(MUC5AC)和黏蛋白5B(MUC5B)呈高表達(dá)[4-5]。并且研究證實(shí)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、輔助性T細(xì)胞2(Th2) 可以促進(jìn)MUC5AC的產(chǎn)生[6-7]。但是關(guān)于CRS中HIF-1α、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 M1(FoxM1)與黏蛋白(MUC)的研究不多。因此,本研究觀察患者鼻竇黏膜中HIF-1α、FoxM1、MUC5AC、MUC5B的表達(dá),進(jìn)一步探討其在CRS中的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月—2018年5月南充市中心醫(yī)院行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的伴鼻息肉的CRS患者(CRS wNP組)和不伴鼻息肉的CRS患者(CRS sNP組)各40例。納入標(biāo)準(zhǔn):①參考2020年歐洲關(guān)于鼻-鼻竇炎和鼻息肉的立場(chǎng)文件[3]診斷為CRS。②無其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病。③患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①前期手術(shù)史。②入院前2周給予過糖皮質(zhì)激素及抗生素。CRS wNP組患者中男25例,女15例;年齡24～64歲,平均(34.3±3.5)歲;CRS sNP組患者中男23例,女17例;年齡23～65歲,平均(35.1±4.1)歲。所有患者內(nèi)鏡下均取鼻竇病變黏膜。另取30例正常鼻腔黏膜作為對(duì)照組,因鼻中隔偏曲需行鼻鏡手術(shù)者,男18例,女12例;年齡20～61歲,平均(33.1±3.8)歲。各組患者的年齡、性別等一般資料之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲南充市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批[2022年審(083)號(hào)]。

1.2 方法 獲取標(biāo)本后,分為兩份,一份置于4%多聚甲醛中固定,用于免疫組織化學(xué)檢查;另一份置于液氮中,并轉(zhuǎn)入冰箱中保存,用于逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定。

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 石蠟包埋組織連續(xù)切片(厚度2 μm),切片常規(guī)脫蠟,梯度酒精法脫水,在含有煮沸的檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中抗原修復(fù),冷卻至室溫,利用3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化酶,山羊血清封閉10 min,滴加一抗MUC5AC、MUC5B(美國Santa Cruz公司)及FoxM1、HIF-1α(美國Abcam公司),孵育30 min,滴加二抗(北京中杉公司),室溫孵育30 min。加DAB 顯色劑,蘇木精復(fù)染,鹽酸乙醇分化,脫水透明和中性樹膠封片,以PBS代替一抗作對(duì)照。結(jié)果判定:采用雙盲法,通過光學(xué)顯微鏡行5個(gè)高倍鏡視野觀察,由Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定陽性染色面積占上皮總面積的百分率。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè) 提取總RNA,測(cè)定總RNA 的濃度和純度,根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)操作合成cDNA。以cDNA為模板,加入相應(yīng)的特異引物,設(shè)定PCR程序,行PCR擴(kuò)增。MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)循環(huán)條件相同。擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。在紫外檢測(cè)儀下觀察特異擴(kuò)增條帶,以相對(duì)應(yīng)的β-actin為內(nèi)參,應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物條帶的密度值進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1和β-actin目的基因qPCR 引物

2 結(jié)果

2.1 各組免疫組化結(jié)果分析 MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1在各組黏膜上皮中陽性面積均差異明顯(P<0.001),CRS wNP組和CRS sNP組各指標(biāo)陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05),而CRS wNP組和CRS sNP組的各指標(biāo)陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 MUC5AC、MUC5B、FoxM1、HIF-1α的免疫組織化學(xué)染色(400×)

表2 MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1在各組黏膜上皮中陽性面積的比較

2.2 qRT-PCR結(jié)果分析 3組MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有明顯差異(P<0.001),CRS wNP組和CRS sNP組各指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05),而CRS wNP組和CRS sNP組各指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1 mRNA的表達(dá)情況

2.3 HIF-1α、FoxM1與MUC5AC、MUC5B mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Person分析結(jié)果顯示,CRS wNP組和CRS sNP組中HIF-1α與MUC5AC及MUC5B mRNA 的表達(dá)均存在正相關(guān)(P<0.001),且FoxM1與MUC5AC及MUC5B mRNA 的表達(dá)也均存在正相關(guān)(P<0.001)。見表4。

表4 各指標(biāo)之間的相關(guān)性

3 討論

CRS是臨床上常見疾病,主要癥狀為鼻塞和膿涕、嗅覺減退、鼻面部脹痛等,且持續(xù)超12周,這一系列癥狀對(duì)患者生活質(zhì)量造成很大影響[8-9]。近年來,隨著藥物治療的逐漸規(guī)范及鼻內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,CRS臨床療效得到了明顯提高[10]。然而目前有關(guān)CRS的發(fā)病機(jī)制仍不清晰,引起本病發(fā)生發(fā)展的因素有很多,例如促炎因子、真菌及細(xì)菌感染等。炎癥反應(yīng)是本病發(fā)生過程中的重要機(jī)制之一,黏膜炎癥導(dǎo)致蛋白的免疫,代謝和組織重塑過程的增加[11]。病理檢查發(fā)現(xiàn),MUC作為CRS的氣道粘液的重要組成部分,炎癥反應(yīng)下鼻腔中MUC分泌明顯增加。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞和腺體細(xì)胞增生會(huì)導(dǎo)致MUC基因的表達(dá)增加,引起黏液增多,而黏液無法及時(shí)排出會(huì)進(jìn)一步刺激鼻腔及鼻竇分泌膿性分泌物,促使該疾病長期發(fā)作,形成一種慢性炎癥[12]。

近年來,在氣道慢性炎性反應(yīng)中的研究逐漸關(guān)注MUC調(diào)控表達(dá)的作用。黏液高黏彈性主要是因?yàn)镸UC的存在,呼吸道中MUC主要分為3類:第一類分泌但不聚合的粘蛋白(MUC7),第二類分泌并聚合形成凝膠的粘蛋白(MUC5AC,MUC5B),最后跨膜結(jié)構(gòu)域且與細(xì)胞表面相關(guān)的粘蛋白(MUC1,MUC4,MUC16,MUC20);其中MUC5AC和MUC5B這兩種分泌性MUC被認(rèn)為與呼吸道炎性疾病有密切關(guān)系,前者主要表達(dá)于氣道上皮的杯狀細(xì)胞上,后者主要表達(dá)于黏膜下腺體內(nèi)[13]。CRS sNP和CRS wNP在鼻竇黏膜中主要的凝膠形成粘蛋白為MUC5B和MUC5AC;有研究已提出通過抑制鼻竇MUC可以達(dá)到降低粘液分泌目的[14]。本研究的免疫組化和qRT-PCR結(jié)果顯示,MUC5AC、MUC5B在伴或不伴鼻息肉CRS患者中均有表達(dá)且較對(duì)照組升高;表明鼻腔其粘液中MUC5AC、MUC5B蛋白含量也升高;因此MUC5AC、MUC5B在CRS病理中都發(fā)揮著重要的作用。與Tong等[15]研究結(jié)果相似。目前分析相比于CRS wNP組,CRS sNP組的MUC5AC、MUC5B mRNA相對(duì)表達(dá)量顯示出無明顯差異。

CRS的炎性反應(yīng)導(dǎo)致鼻腔粘液分泌過多,而HIF-1α在這反應(yīng)過程中發(fā)揮作用[16]。HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,可以調(diào)控MUC的表達(dá),其在哮喘、慢性阻塞性肺疾病等下呼吸道疾病中作用都有報(bào)道,并且其與杯狀細(xì)胞的增生有關(guān)[17]。HIF-1α是一種在鼻黏膜漿液細(xì)胞中表達(dá),在鼻黏膜粘液細(xì)胞中不表達(dá)因子;它可以引起鼻腔粘液增多,粘液增多破壞了原本鼻腔黏膜環(huán)境;所以鼻腔粘液平衡或許是CRS發(fā)生的關(guān)鍵因素[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α在伴或不伴鼻息肉CRS患者中有較強(qiáng)表達(dá),且明顯高于對(duì)照組,與MUC5AC、MUC5B的表達(dá)存在明顯的相關(guān)性。HIF-1αmRNA表達(dá)增強(qiáng),可以促進(jìn)MUC表達(dá)提高進(jìn)而發(fā)生CRS。與賀旭東等[19]通過PCR檢測(cè)分析得出結(jié)論相似。國外學(xué)者表示在低氧刺激下會(huì)引起HIF-1α的活化增多,而在HIF-1介導(dǎo)下引起黏液增多及MUC5AC的表達(dá)增強(qiáng)[20]。

FoxM1是Fox基因家族的成員,參與細(xì)胞增殖、分化、血管形成、凋亡等多種生物學(xué)作用,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[21]。FoxM1是基因表達(dá)和細(xì)胞循環(huán)機(jī)制等生理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[22]。有研究者發(fā)現(xiàn)CRS鼻黏膜中FoxM1表達(dá)上調(diào),且發(fā)現(xiàn)是多種炎性因子導(dǎo)致鼻黏膜上皮細(xì)胞FoxM1表達(dá)增多;FoxM1增多可以促進(jìn)黏膜杯狀細(xì)胞的分化以及炎性細(xì)胞的浸潤[23]。本研究中,在兩組CRS患者鼻黏膜中FoxM1有較強(qiáng)表達(dá),且明顯高于對(duì)照組,與MUC5AC、MUC5B的表達(dá)存在明顯的相關(guān)性。FoxM1 mRNA表達(dá)增強(qiáng),可以促進(jìn)MUC表達(dá)進(jìn)而發(fā)生CRS。有國外研究者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1可以增加MUC5AC、MUC5B表達(dá)[24]。FoxM1可以促進(jìn)樹突細(xì)胞的抗原遞呈,誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞的分化,而且其可通過SPDEF轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控MUC5AC、MUC16等的表達(dá)。還有學(xué)者認(rèn)為CRS患者鼻黏膜FoxM1的高表達(dá)后,通過信號(hào)通路來介導(dǎo)炎癥反應(yīng),能夠增加細(xì)胞因子的分泌與合成[25]。

本研究通過免疫組化及qRT-PCR發(fā)現(xiàn):CRS中長期的炎癥刺激,導(dǎo)致杯狀細(xì)胞的HIF-1α表達(dá)增強(qiáng),進(jìn)一步促進(jìn)MUC5AC、MUC5B表達(dá)使鼻腔粘液增多,最后引起一種病理性的惡性循環(huán),根據(jù)研究結(jié)果顯示HIF-1α表達(dá)與MUC5AC、MUC5B正相關(guān);同理FoxM1與MUC5AC、MUC5B也正相關(guān);因此可以發(fā)現(xiàn)FoxM1、HIF-1α表達(dá)與MUC5AC、MUC5B也正相關(guān)。但是關(guān)于HIF-1α、FoxM1與MUC5AC、MUC5B具體調(diào)控機(jī)制研究較少,有待于進(jìn)一步研究。本研究中CRS wNP組和CRS sNP組的MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,原因可能是雖然CRS wNP和CRS sNP這兩種類型間存在一定的形態(tài)學(xué)差異,然而本質(zhì)上都是慢性炎癥反應(yīng),病程長,在炎癥狀態(tài)下鼻腔中黏膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重塑,進(jìn)而在病理特征上存在類似的地方,都可以調(diào)節(jié)黏液表達(dá),所以在伴或不伴鼻息肉的組織上MUC5AC、MUC5B、HIF-1α、FoxM1的差異不明顯;這也說明在CRS wNP和CRS sNP鼻腔粘液表達(dá)情況本質(zhì)可能是一樣;還可以為它們調(diào)控機(jī)制存在許多共同點(diǎn)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在伴或不伴鼻息肉的CRS中,HIF-1α和FoxM1的表達(dá)均上調(diào),且與黏蛋白MUC5AC、MUC5B呈正相關(guān),HIF-1α和FoxM1在CRS中黏液生成增多中具有重要的作用。隨著對(duì)HIF-1α和FoxM1信號(hào)通路與CRS關(guān)系,特別是對(duì)該通路在MUC合成的調(diào)控機(jī)制方面更進(jìn)一步的研究,可以使人們更加了解CRS的發(fā)病機(jī)制,甚至可以為治療CRS提供新的方向。