超聲微泡造影劑攜綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠股骨頭的研究

陳 磊，張 莉

（齊魯醫(yī)藥學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，山東 淄博255300）

超聲微泡造影劑具有靶向運載作用已在很多實驗研究中得到證實［1-4］,利用微泡在超聲介導(dǎo)下的空化效應(yīng)，可以靶向傳輸基因或藥物,達到治療疾病的目的.目前以超聲微泡造影劑為載體治療的疾病很多，主要集中在腫瘤［5-8］以及某些缺血性疾?。?-13］等.還未見有超聲微泡造影劑治療骨組織疾病的相關(guān)報道.本實驗通過超聲微泡造影劑攜綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pIRES2-EGFP）轉(zhuǎn)染大鼠股骨頭組織，研究這種方法的安全性和可行性，為以后利用此方法治療骨科疾病提供理論基礎(chǔ).

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物

7周齡SPF級SD大鼠40只，體重180～230 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（許可證號：SCXK［魯］20140007）提供，雌雄不拘，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，溫度 25±1℃.

1.2 實驗試劑

免疫熒光蛋白質(zhì)粒 （pIRES2-EGFP）、DH5a感受態(tài)、RNA酶和質(zhì)粒提取試劑盒采自武漢淼靈生物科技有限公司.超聲微泡造影劑凍干粉（SonoVue）采自上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司（國藥準字J20130045）.HE試劑盒采自武漢博士德生物科技有限公司.EDTA脫鈣液、PBS液、4%多聚甲醛采自北京索萊寶生物科技有限公司.超聲診斷儀由齊魯醫(yī)藥學(xué)院影像系提供.

1.3 相關(guān)液體配制

（1）超聲微泡造影劑懸濁液：用0.9%無菌鹽水5 mL注入超聲微泡造影劑瓶中，輕搖并擱置1～2分鐘，待瓶中凍干粉完全溶解后使用.

（2）超聲微泡造影劑攜免疫熒光蛋白質(zhì)粒懸濁液：將68 μL微泡造影劑和200 μg免疫熒光蛋白質(zhì)粒溶入 1 mL 懸濁液中［14］.

1.4 實驗動物處理

40只大鼠隨機分為實驗組30只和對照組10只.實驗組再分為A、B、C 3組，并做以下處理：

A組：經(jīng)尾靜脈注射超聲微泡造影劑懸濁液（0.5 mL/kg），再分為A1和A2組各5只；

B組：經(jīng)尾靜脈注射免疫熒光蛋白質(zhì)粒（0.5 mL/kg），再分為B1和B2組各5只；

C組：經(jīng)尾靜脈注射超聲微泡造影劑攜免疫熒光蛋白質(zhì)粒懸濁液（0.5 mL/kg），再分為C1和C2組各5只；

對照組：經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，再分為對照1組和對照2組各5只.

其中A1、B1、C1、對照1組用3 MHz超聲波在股骨頭部照射，A2、B2、C2、對照2組不用超聲波照射.轉(zhuǎn)染7天后，處死全部大鼠，取股骨頭做病理HE染色，觀察其安全性；免疫熒光顯微鏡觀察，每組取7～10張切片，每張切片拍1張照片，在Image Pro Plus圖像分析軟件下進行分析，所得灰度數(shù)據(jù)與表達強弱成反比，觀察其可行性.所得實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示，所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5和SPSS 18.0進行分析，結(jié)果以P＜0.05為差異顯著的標準.

2 實驗結(jié)果

2.1 安全性研究

2.1.1 形態(tài)觀察

在轉(zhuǎn)染7天過程中，實驗組大鼠毛發(fā)光澤，活動靈活，反應(yīng)靈敏，食欲良好，體重逐漸上升，抓取時能激烈反抗，形態(tài)與對照組無明顯差異.

2.1.2 HE染色觀察

空骨陷窩計數(shù)：對照組和實驗組股骨頭軟骨層較厚，成骨活躍，軟骨下骨小梁排列規(guī)則整齊，致密飽滿，骨細胞清晰可見，核較大，多位于中央，偶見骨陷窩空虛，髓腔內(nèi)可見增生活躍的骨髓組織，造血細胞豐富，無明顯差異（P＞0.05），見表 1.

表1 各組實驗動物空骨陷窩數(shù)比較 （±s；n=5）

表1 各組實驗動物空骨陷窩數(shù)比較 （±s；n=5）

注：與對照組比較，▲P＞0.05.

空骨陷窩計數(shù)/%14.50±1.72對照 2 組 14.30±1.46 A1 組 13.80±1.83▲A2 組 14.50±1.26▲B1 組 14.60±1.81▲B2 組 13.90±1.72▲C1 組 14.30±1.59▲C2 組 14.30±1.73▲組 別對照1組

取股骨頭從中剖開，股骨頭外觀未見變形，骨質(zhì)堅硬，不易剖開，軟骨組織致密而有光澤，4%多聚甲醛固定10 h，后用EDTA脫鈣15 d，包埋切片約3～4 μm薄片，用HE染色，顯微鏡下觀察對照組（圖1、圖2）大鼠股骨頭骨組織與實驗組（圖3、圖4）無明顯損傷.

圖1 對照組 骨小梁及髓腔結(jié)構(gòu) HE×100

圖2 對照組 正常骨細胞及骨陷窩結(jié)構(gòu)HE×200

圖3 C1組骨小梁及髓腔結(jié)構(gòu)HE×100

圖4 C1組骨細胞及骨陷窩結(jié)構(gòu)正常HE×200

2.2 可行性研究

取股骨頭從中剖開，4%多聚甲醛固定10 h，后用EDTA脫鈣15 d，包埋切片約3～4 μm薄片，免疫熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)對照1、2組和A1、A2組未見表達，C1與其它3組對比有明顯差異性（P＜0.01），見圖5.

圖5 各組熒光蛋白質(zhì)粒表達情況

3 討論

超聲微泡造影劑主要成份是醫(yī)用高分子聚合材料，這些材料以合成的可降解的聚合物體系為主，在體內(nèi)能自然降解，沒有明顯毒副作用［15］.在本實驗中，對照組和實驗組大鼠無論從形態(tài)觀察還是股骨頭骨組織HE染色觀察，均無明顯差異（P＞0.05）.由此可以證明，超聲微泡造影劑攜免疫熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠骨組織是安全的.

質(zhì)粒+照射組、單純質(zhì)粒組、微泡攜質(zhì)粒+照射組以及單純微泡攜質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后都有蛋白表達，但微泡攜質(zhì)粒+照射組（C1組）表達最顯著.可見，超聲微泡造影劑攜免疫熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠股骨頭是安全可行的.目前，骨科疾病的基因治療正在廣泛開展，但研究方向以基因較多，基因載體相對較少.利用超聲微泡造影劑作為一種載體攜基因質(zhì)粒（如VEGF基因質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染治療骨科疾?。ㄈ绻晒穷^壞死）的可行性，還需要進一步探討.