體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

潘　勇　艾玉峰

作者單位：第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科中心（西安710032）

摘要目的：研究在體外培養(yǎng)條件下兔血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(E CCM)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Endothelial-coverting enzyme inhibit or)Phosphoramidon 對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖的影響，同時(shí)研究了血管平滑肌細(xì)胞條件 培養(yǎng)基(SMCCM)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)增殖方面的影響。方法：EC和SMC均來(lái)源于兔主動(dòng)脈，在 獲得了EC和SMC的條件培養(yǎng)基(CM)后，分別用兩者以及ET-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞的增殖率通過(guò) 3H摻入法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：ECCM和ET-1可明顯促進(jìn)SMC的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性。其最大 效應(yīng)分別為190%±11%(100% ECCM)和166%±9%(100pg/ml ET-1)。而Phosphoramidon存在條 件下的ECCM使其分裂作用降低33%±2%。SMCCM抑制EC的增殖，這種抑制作用并非劑量依賴性 ，其最大的抑制效應(yīng)為基本水平的78%±3%。結(jié)論：ECCM和ET-1可促進(jìn)SMC的增殖。Phospho ramidon可明顯地抑制ECCM對(duì)SMC的增殖作用。同時(shí)SMCCM對(duì)EC的增殖起抑制作用。

關(guān)鍵詞血管內(nèi)皮細(xì)胞血管平滑肌細(xì)胞增殖

MODULATIONS OF PROLIFERATION BETWEEN VASCULAR ENDOTHELIAL CELL AND VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELL IN VITRO

Pan YongAi Yufeng

Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital,Fourth Military Medical Uni versity(Xian 710032)

ＡｂｓｔｒａｃｔAim:To study the effects of vascular end othelial cell conditioned medium(ECCM), endothelin-1 (ET-1), Endothelin-conve rting enzyme inhibitor Phosphoramidon on the proliferation of vascular smooth mu scle cell (SMC) and vascular smooth muscle cell conditioned medium(SMCCM) on theproliferation of vascular endothelial cell(EC)in vitro.Methods:EC and SMC wereisolated from rabbit aortas and cultured.The conditioned medium(CM) of EC and SM C were harvested.ECCM,ECCM conditioned in the presence of Phosphoramidon,SMCCM a nd ET-1 were added individually to the cultures.Proliferation rate of the cellswas measured with 3 H-thymidine incorporation on 3 days.Result:ECCM and E T-1 significantly increased the proliferation of SMC in a dose-dependent manne r with a maximal effect of 199%±11%(100% ECCM) and 166%±9%(100pg/ml ET-1)resp ectively.ECCM conditioned in the presence of Phosphoramidon reduced the mitogeni c effect by 33%±2%.SMC conditioned medium elicited a dose dependent decrease ofcultured EC proliferation with a maximal effect of 78%±3% over basal level.C onclusion:ECCM and ET-1 had a mitogenic effect on SMC.Phosphoramidon could sign ificantly reduce the mitogenic effect of ECCM.SMCCM had an effective inhibitionon EC proliferation.

ＫｅｙｗｏｒｄｓVascular endothelial cellVascular smoo th muscle cellProliferation

血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和平滑肌細(xì)胞(SMC)是大血管壁的兩種主要細(xì)胞 類型，在結(jié)構(gòu)及功能上存在密切聯(lián)系，血管內(nèi)皮層的完整對(duì)血管的穩(wěn)定性起著很大作用 ^〔1〕，EC通過(guò)釋放血管收縮和舒張物質(zhì)，且在二者的相互影響下調(diào)節(jié)著血管的緊張程度 。此外SMC也影響著EC血管活性因子的合成與分泌。本研究是組織工程人工血管實(shí)驗(yàn)研究的 一部分，其目的是為EC和SMC間復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，即有關(guān)細(xì)胞復(fù)制、生長(zhǎng)因子活性和增殖方 面提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要研究①血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ECCM)、內(nèi)皮素-1(ET -1)和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Endothelial-coverting enzyme inhibitor)Phosphoramidon存在條件下ECCM對(duì)SMC增殖的影響作用；②血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SMCCM)對(duì)體外培養(yǎng)的 EC增殖作用的影響。實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)方法排除血管壁其它組成部分可能存在的干擾作用。

1材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

EC來(lái)源于重2.5kg～3.0kg新西蘭雄性家兔的主動(dòng)脈。家兔由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提 供。動(dòng)物經(jīng)戊巴比妥鈉(30mg～40mg/kg，iv)麻醉后，無(wú)菌條件下取出主動(dòng)脈，迅速放入PBS 液中。將血管內(nèi)徑翻轉(zhuǎn)，沖凈內(nèi)壁后，放入含1mg/ml膠原酶(Ⅰ型，Gibco公司)、4mg/ml牛 血清白蛋白的DMEM(Dulbeccos midufued Eagle medium,Gibco公司)培養(yǎng)液中，放于37℃條 件下25分鐘。收集消化液并離心，將離心下的兔主動(dòng)脈EC吹打均勻，培養(yǎng)在含20%新生牛血 清(Hyclone公司)的DMEM液中。當(dāng)細(xì)胞融合為單層時(shí)，用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。實(shí) 驗(yàn)采用的EC為第3～8代細(xì)胞。SMC采用組織塊法進(jìn)行培養(yǎng)，即將血管平滑肌層切割成1.0mm₃2的小塊，然后在10%新生牛血清(Hyclone公司)的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、95%空氣。每周更換培養(yǎng)液2次。當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到相對(duì)融合狀態(tài)時(shí)，用 0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。實(shí)驗(yàn)采用的SMC為第2～6代細(xì)胞。

1.2條件培養(yǎng)液(CM)收集

為了獲得CM，將兩種細(xì)胞分別種植于24孔培養(yǎng)板中(EC和SMC分別為10⁵/孔)，加入含10%新 生牛血清的1ml DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后即牢固地貼附在每孔的底部形成單層。第二日 ，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液清洗孔內(nèi)的EC或SMC各四次。在第3次和第4次沖洗的間隔中，將細(xì) 胞在無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液、37℃條件下培養(yǎng)3小時(shí)，以便更完全地去除血清蛋白。在4次沖洗 完成后，1ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液加入到EC或SMC培養(yǎng)的孔中。其中部分EC的培養(yǎng)板孔中，加入 含10μ mol/l Phosphoramidon的1ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。在繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，ECCM或SMCC M加入到培養(yǎng)細(xì)胞中以測(cè)定其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.3ET-1和Phosphoramidon

在體外條件下，測(cè)定內(nèi)皮素對(duì)SMC增殖的刺激作用時(shí)，應(yīng)用的是合成的內(nèi)皮素-1(ET-1，F(xiàn)l uca 公司)。ET-1溶液是將其溶解于無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液中配制而成。其用于SMC增殖試驗(yàn) 濃度介于0.01pg/ml和100pg/ml之間。將含Phosphoramidon(10μ mol/L)的ECCM加入到培養(yǎng) 的SMC中，以估計(jì)ECCM中ET-1對(duì)SMC生長(zhǎng)的作用。

1.4細(xì)胞增殖的測(cè)定

細(xì)胞增殖的測(cè)定是采用常見的³H摻入法。簡(jiǎn)要地說(shuō)，分別將EC和SMC用胰蛋白酶消化后， 接種在96孔板中(10⁴2/孔)，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液(100μl/孔)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò) 夜后，類似于收集條件培養(yǎng)基一樣，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液連續(xù)沖洗4次。沖洗完成后，ECCM 加入到SMC培養(yǎng)系統(tǒng)中。同理，SMCCM加入到EC培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞培養(yǎng)于微孔中，37℃條件下 培養(yǎng)3天。所選擇的培養(yǎng)時(shí)間是按Leszczynski等報(bào)導(dǎo)的^〔2〕。在培養(yǎng)第3天之前的最 后6個(gè)小時(shí)內(nèi)，將〔³H〕-TdR(3.7kBq/10⁴2個(gè)細(xì)胞)分別加入到EC和SMC培養(yǎng)系統(tǒng)中。當(dāng) 培養(yǎng)期終止時(shí)，沖洗微孔中的細(xì)胞，在β計(jì)數(shù)器中收集并記數(shù)。

1.5記數(shù)與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，其結(jié)果表示為±S，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差 分析，差異性顯著(P＜0.05)。

2結(jié)果

2.1條件培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞增殖的影響

所有實(shí)驗(yàn)均采用無(wú)血清培養(yǎng)基避免各種血清源性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子的存在。在相差顯微鏡下觀察 EC或SMC在無(wú)血清培養(yǎng)液中的形態(tài)、生長(zhǎng)方式呈正常狀態(tài)(圖1、2)。在加入條件培養(yǎng)基后， 于無(wú)血清條件下培養(yǎng)72小時(shí)，EC或SMC同樣無(wú)形態(tài)及外觀的改變。

無(wú)血清培養(yǎng)條件下相差顯微鏡觀察融合的單層EC呈典型的" 鵝卵石"樣外觀?！?00

在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)EC 24小時(shí)所獲取ECCM有強(qiáng)烈的促增殖作用。不同 濃度的ECCM(25%、50%、100%)可明顯增加SMC的增殖。在培養(yǎng)3天后，與在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液 中培養(yǎng)的SMC相比較，ECCM(100%)可使SMC增殖增加90%(P＜0.05)。(圖3)

圖3不同濃度的ECCM作用SMC 3天對(duì)其增殖的影響

當(dāng)采用不同濃度的SMCCM(25%、50%、100%)處理EC，隨著濃度增加，EC的增殖 率降低。SMCCM可降低〔³H〕-TdR摻入量約78%(P＜0.05)。(圖4)

2.2ET-1對(duì)SMC生長(zhǎng)的影響

將外源性的ET-1(0.01～100pg/ml)加入到SMC培養(yǎng)系統(tǒng)中，它可對(duì)SMC產(chǎn)生 濃度依賴性增殖作用。ET-1的終濃度為100pg/ml。其最大效應(yīng)為166%±9%(圖5，P ＜0.05)。為了證實(shí)ET-1是ECCM中促進(jìn)SMC增殖的主要?jiǎng)恿?，故在ECCM中加入Phos phoramidon(10μ mol/L)。在ECCM的濃度為15%時(shí)，這一處理可使細(xì)胞增殖率降低33%±2%( P＜0.05)，由于Phosphoramidon對(duì)SMC的增殖并無(wú)作用，故以上結(jié)論得到 了證實(shí)。

圖4不同濃度的SMCCM作用EC 3天對(duì)其增殖的影響

圖5不同濃度的ET-1作用SMC 3天的增殖狀況。數(shù)值為以與基數(shù)條 件下(指SMC在含ET-1的無(wú)血清條件下的增殖狀況)³H摻入量相比的百分?jǐn)?shù)。以上各結(jié)果采 用±S表示(n=3)

3結(jié)論

許多資料顯示EC或SMC，即大血管壁的兩種主要細(xì)胞類型，顯然有能力產(chǎn)生一些細(xì) 胞因子，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式，影響到細(xì)胞的遷移與增殖^〔3〕。

EC可以合成大量的物質(zhì)如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1) 、ET-1等，它們都可明顯地促進(jìn)SMC的增殖^〔4〕。本實(shí)驗(yàn)表明將EC培養(yǎng)在無(wú)血清條 件下所獲得的ECCM可明顯地促進(jìn)SMC的增殖，這一結(jié)論與其它一些研究者的相類似^〔5〕 。將外源性的ET-1加入到培養(yǎng)的SMC中時(shí)，它所起到的是一種增殖因子的作用。而且，在 本實(shí)驗(yàn)中，含有內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶抑制劑Phosphoramidon的ECCM將阻礙體外培養(yǎng)的EC的分泌作用 。這一處理減少了ECCM誘導(dǎo)的SMC的增殖作用，從而闡明ET-1可能參與了EC對(duì)SMC增殖方面 的調(diào)節(jié)作用。

為進(jìn)一步研究體外條件下EC和SMC之間的相互影響，我們將SMCCM加入到EC培養(yǎng)系統(tǒng)中，結(jié)果 顯示SMCCM對(duì)于體外培養(yǎng)的EC具有明顯的抑制作用。

近來(lái)，一些作者報(bào)導(dǎo)SMC也可能產(chǎn)生某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，如內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)，腫瘤 生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)^〔6〕等。EC是僅有的一種表達(dá)ECGF受體的細(xì)胞^〔7〕 。而且，一些SMC產(chǎn)生的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)于血管內(nèi)的各種細(xì)胞類型有著不同的作用^〔8〕 。具有多種功能的TGF-β，可促進(jìn)SMC的遷移但同時(shí)抑制EC的遷移。也有報(bào)導(dǎo)稱SMCCM能 夠明顯地減少EC產(chǎn)生的ET-1，這可能是由于SMC自身產(chǎn)生了一種抗增殖作用，因此細(xì)胞壁的 細(xì)胞與細(xì)胞間必然存在著一定的平衡。我們的結(jié)果與認(rèn)為一個(gè)被觀察到的血管反應(yīng)是幾類細(xì) 胞和多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)成份相互作用結(jié)果的觀點(diǎn)相一致。為了使組織工程人工血管的研究進(jìn)一步 深化，研究不同條件下血管壁細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)介質(zhì)和調(diào)節(jié)因子是未來(lái)的主要任務(wù)之一。

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收稿日期2000-03-05

編輯/姜如蓉