電針對脊髓損傷后γ-谷氨酰轉移酶活性影響的實驗研究

孫雙歷 嚴振國

(上海中醫(yī)藥大學,上海200032)

摘 要 對大鼠脊髓損傷后的1周、4周、8周測定其損傷處脊髓的γ-谷氨酰轉移酶活性,觀察電針對損傷后脊髓星形細胞代謝的影響。結果,在1周時電針組與激素組比較療效相近,與造模組比較,差異均有顯著性意義(P<0.05),在4周時電針組與激素組及激素組與造模組比較,差異有顯著性意義(P<0.05),電針組與造模組比較,差異有非常顯著性意義(P<0.01);在8周時電針組與激素組及激素組與造模組比較,差異有顯著性意義(P<0.05),電針組與造模組比較,差異有非常顯著性意義(P<0.01)。證實電針對損傷脊髓的修復有積極的促進作用。

主題詞 電針 脊髓損傷/針灸療法 γ-谷氨酰轉移酶/代謝祖國醫(yī)學認為脊髓損傷(SCI)屬"痿證""傷筋"范疇,并以針灸治療,目前針灸療法越來越多被用于該病的實驗與臨床。本研究從實驗角度入手,對標志星形細胞攝取氨基酸的脂膜結合蛋白酶γ-谷氨酰轉移酶(簡稱γ-GT)的活性進行測定,以觀察針刺對脊髓損傷后星形細胞功能的影響。

1 材料和方法1.1 材料(1)動物:雌性Wister大鼠,體重160～200g,8～10周,實驗結束時180～230g。由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

(2)脊髓損傷模型制備[1,2]大鼠稱重后,以2%戊巴比妥鈉溶液(35mg/kg)腹腔注射麻醉,俯臥位固定于手術臺上,背部剪毛消毒,切開皮膚,剝離肌肉,咬除椎板,將脊髓暴露完全,將自制的ALLEN錘(50g/cm)對準胸12脊髓,穩(wěn)定脊柱,將錘落下,迅速移走ALLEN錘,消毒后縫合。

在ALLEN錘落下后,動物下肢驟然伸直,尾巴搖擺后下肢自然屈曲。

(3)主要試劑和儀器γ-GT(上海北海試劑公司生產),0.85%NaCl(無菌),勻漿器,離心管,高速低溫離心機,全自動生物素測定儀(美國產BECBMANCX-4型)。

1.2 方法(1)動物分組及處理將成功造模后的60只動物隨機分為3組:電針組、激素組、造模組。電針組于造模6小時后于非固定狀態(tài)下開始針刺,每日針刺1次,每次15min,6天為1個療程共治療8個療程。激素組于造模后5min開始皮下給予地塞米松(5mg/kg)[3],以后依次為6小時、18小時、24小時后給藥,共4次,給藥期間同時給予腹腔注射慶大霉素(0.6萬U/100g)。造模組:造模后放于籠中正常飼養(yǎng)觀察,不作任何治療。各組在2周內均予以協(xié)助排尿。

(2)針刺處方及刺激參數(shù)穴位:第一組,督脈上的"大椎"和"命門"穴;第二組,胸12上下的"夾脊"穴,二組交替使用。

參數(shù):電針頻率2Hz,電流6mA,波形疏波。分別加上陰陽極,以針刺處的背部肌肉輕微跳動為度。

1.3 檢測項目[4](1)制備脊髓勻漿液心臟穿刺致死大鼠,切取以胸12為中心上下共長1cm去脊髓外膜,每0.3g脊髓重量加1ml的生理鹽水,冰浴中勻漿后離心(4℃,3000r/min),15min,吸取上清液至無菌瓶中待測。

(2)測試將全自動生物素測定儀調節(jié)穩(wěn)定后放入樣本進行測定。

1.4 統(tǒng)計學方法:t檢驗。2 結果見表1。

第1周:電針組與激素組比較,差異無顯著意義,但二組與造模組比較差異均有顯著意義(P<0.05),與正常組比較γ-GT活性均增高,造模組明顯降低。

第4周:電針組與激素組及造模組比較,差異均有顯著性意義(P<0.05),激素組與造模組比較,差異也有顯著性意義(P<0.05),與正常組比較,激素組和造模組的γ-GT活性呈降低態(tài)勢,電針組則明顯增高。

第8周:差異情況與第4周時相同,但與正常組比較激素組與造模組的γ-GT活性仍呈降低態(tài)勢,電針組的γ-GT活性也較第1周及第4周為低。

3 討論3.1 類固醇激素的治療及存在的問題關于類固醇治療SCI的依據(jù)均源自動物實驗。Ducker等首先報道了用類固醇激素治療動物脊髓損傷:給狗造成315g/cm損傷,3小時后肌注地塞米松1周,12只狗中有4只功能恢復接近正常[5]。日前該藥已由動物實驗過渡到了臨床應用,對其研究認為該藥可提高神經的興奮性與傳導[6],改善脊髓的血流量[7,8],減少脂質過氧化,除此之外還可促進分泌NGF生長因子[9,10]。目前,在治療脊髓損傷中美國在1985年急性脊髓損傷研究中肯定了類固醇激素的作用,然而對于它的應用也還存有一些問題:1)用藥時間必須在8小時之內,對地塞米松的要求則在1小時以內,超過此時限將無效。2)大劑量使用后的副作用如感染和創(chuàng)傷后的應激狀態(tài)會導致病人血糖增高,抵抗力降低加重感染。3)療程有時限:盡管該藥療效顯著,但不可能長期大劑量使用。因此對于SCI的治療應采用分階段有重點、并采用多種方法結合治療方可取得更佳之療效。

3.2 大鼠SCI模型的建立動物模型的成功建立是研究SCI病理及評價方法是否有價值的基本要求。至今,僅機械損傷模型就包括很多如(1)脊髓挫傷(重物墜落致傷和壓迫致傷),(2)脊髓震蕩,(3)脊髓牽拉,(4)脊髓切割。造模方式眾多,但選擇的標準是接近臨床損傷癥狀為最佳。

本研究選擇了重物墜落致傷模型(WD法),該法以克厘米為定量單位使物體垂直下落,造成不同程度的脊髓損傷,該法簡單易行,其打擊的量可以控制和計算,創(chuàng)傷的位置可以通過手術限定,故定量標準,控制性能好,不撕破脊髓硬脊膜,重物也不切割脊髓,可以防止結締組織或其它外來成分侵入損傷處從而影響研究結果。我們在原造模的基礎上進行了一些改良:如固定動物,造拱形手術臺,穩(wěn)定脊柱,使在打擊的瞬間快速而準確。目前對WD法的研究表明該法致傷模型與人類脊髓損傷的相關性最好,它所產生的缺血、缺氧等一系列繼發(fā)損傷與臨床所見的損傷基本相符[10～12],因此該法在SCI的實驗研究方面得到了較多的運用。

由于本實驗在造模后2周內協(xié)助大鼠排尿,因此一定程度上降低了各組動物的死亡率,特別是對造模組大鼠,往往協(xié)助它們排尿的時間相對較長。

3.3 γ-GT的生理功能γ-GT,是一種分布廣泛的質膜結合糖蛋白,它能催化γ-L-谷氨酰氨基團的轉移,完成γ-谷氨?；h(huán),在細胞攝取氨基酸的過程中發(fā)揮作用;由于它是體內唯一能夠轉移谷胱苷肽(GSH)及其衍生物中γ-谷氨?；拿?因此它參與GSH的合成及分解代謝;另外還有解毒的功能。在胚胎時期中樞內的γ-GT活性較高,說明它與神經系統(tǒng)的生長代謝關系密切[13],并有人據(jù)此測定腦損傷后的γ-GT的活性,認為它與星形膠質細胞的功能活躍及增殖有關[4]。3.4 星形細胞與γ-GT體內及體外的實驗證明:中樞星形膠質細胞具有攝取和釋放谷氨酸(GLU)的能力,是GLU代謝的關鍵部位,星形膠質細胞攝取氨基酸的目的主要是防止過量的GLU釋放到周圍的神經元以免引起神經元的過度興奮[14]。事實上,損傷后脊髓組織興奮性氨基酸的增加,在觸發(fā)SCI后病理改變中起著重要作用,而這種SCI后的興奮性氨基酸的增加可能與突觸的釋放增加,細胞攝取的減少以及血腦屏障受損導致的血漿游離氨基酸移動入神經外間隙等原因有關[15,16]。因此作為血液神經元屏障及腦脊液神經元之間的屏障,一旦星形細胞功能損失,無疑會給神經元的恢復及生長代謝帶來很大的影響。

3.5 電針對γ-GT活性影響的意義我們曾對電針后脊髓損傷大鼠的行為活動進行過觀察,發(fā)現(xiàn)在1～2周內尿便恢復不良的大鼠,則肢體功能恢復不佳甚至死亡,這與由此引發(fā)的感染有關。二種治療手段對于損傷的各階段均有作用,而電針對于后期的康復仍有積極的意義。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)電針治療后各階段均有明顯的γ-GT升高,這對于神經元修復保護有著積極的影響,即使在后期的治療,針刺后損傷段的γ-GT仍有增高,因此認為針刺對后期的治療仍有一定的意義。推測這可能與早期細胞功能減退神經組織水腫,后期出現(xiàn)較大壞死區(qū)域,空洞及瘢痕的形成有一定的關系。

有人研究認為γ-GT的活性升高是與細胞分化和成熟有關[17],在此我們也認同此觀點,針刺提高了γ-GT的活性并非一定是刺激了星形細胞的增殖結果,而可能是以提高了星形細胞的某些功能為主。

曾有研究用免疫組化及電鏡等方法對存活2小時～54年脊髓受損傷后的尸檢材料,發(fā)現(xiàn)即使在創(chuàng)傷4～5個月以后,損傷的脊髓內部也出現(xiàn)許多軸突再生巢,巢內的雪旺氏細胞表達了神經生長因子受體,因此支持并引導中樞軸突的再生,所以后期形成的膠質瘢痕并非絕對不可逾越[18]。對γ-GT的研究表明,除早期的積極治療外,后期適當?shù)乃幬锛捌渌椒ǖ闹委熞埠苡斜匾?而針刺不失為康復期的一種值得選用的方法。

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