miR-535靶向GAB2基因通過激活PI3K/AKT信號通路促進山羊顆粒細(xì)胞增殖

王鵬，劉子嶷，劉玉芳，儲明星

miR-535靶向GAB2基因通過激活PI3K/AKT信號通路促進山羊顆粒細(xì)胞增殖

王鵬，劉子嶷，劉玉芳，儲明星

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽生物育種全國重點實驗室，北京 100193

【背景】MicroRNA（miRNA）是長度為18—25 nt的短RNA分子，在哺乳動物卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)控卵泡發(fā)育過程中起著重要作用。團隊前期對云上黑山羊高、低產(chǎn)羔數(shù)個體卵巢轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，miR-535能夠影響山羊產(chǎn)羔數(shù)，但具體調(diào)控機制尚不清楚?！灸康摹客ㄟ^研究miR-535靶向（GRB2 associated binding protein 2）及其相關(guān)信號通路PI3K/AKT對山羊顆粒細(xì)胞增殖的影響，進一步探討其分子生物學(xué)調(diào)控機制?！痉椒ā吭诒狙芯恐校x擇具有兩胎以上產(chǎn)羔記錄的高、低產(chǎn)云上黑山羊各3只，同期發(fā)情處理后采集卵泡期卵巢組織，收集原代顆粒細(xì)胞。使用熒光定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）檢測miR-535和在云上黑山羊高、低產(chǎn)卵巢組織中的表達量。構(gòu)建GAB2的過表達/干擾載體，使用RT-qPCR、Western blot、免疫熒光、CCK8、EdU和細(xì)胞凋亡檢測候選基因?qū)ι窖蚵殉差w粒細(xì)胞增殖的影響。使用miRDB和miRanda軟件預(yù)測miR-535和GAB2的靶向關(guān)系，構(gòu)建GAB2的野生型和突變型載體，利用雙熒光素酶活性檢驗檢測miR-535和GAB2的靶向關(guān)系。構(gòu)建過表達/干擾miR-535載體，探究其顆粒細(xì)胞增殖及下游基因功能的影響?！窘Y(jié)果】RT-qPCR結(jié)果顯示，在高產(chǎn)云上黑山羊卵巢組織中的表達量顯著低于低產(chǎn)個體，miR-535的表達則相反（＜0.05）；隨后，RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明，在顆粒細(xì)胞中過表達后，CCND2、CDK4和BCL2的表達量顯著升高（＜0.05），BAX的表達量顯著降低（＜0.05），抑制其表達則與之相反；EdU和CCK8檢測顯示，過表達后顯著促進顆粒細(xì)胞增殖（＜0.05），抑制其表達后則相反；雙熒光素酶報告試驗表明，miR-535抑制了GAB2基因3’UTR區(qū)域的雙熒光素酶活性。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，在顆粒細(xì)胞中過表達miR-535后，GAB2、CCND2、CDK4和BCL2的表達量顯著降低（＜0.05），BAX的表達量顯著升高（＜0.05），抑制其表達后則與之相反；EdU和CCK8檢測顯示，miR-535過表達后抑制顆粒細(xì)胞增殖，抑制其表達后則相反；細(xì)胞凋亡試驗表明，miR-535過表達后促進顆粒細(xì)胞增殖，抑制其表達后則相反。在顆粒細(xì)胞中抑制miR-535后，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路標(biāo)志因子AKT1的表達水平顯著升高（＜0.05）?！窘Y(jié)論】miR-535通過抑制的表達，抑制了山羊顆粒細(xì)胞的增殖，為進一步探究miR-535調(diào)控山羊顆粒細(xì)胞的生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)。

山羊產(chǎn)羔數(shù)；卵巢顆粒細(xì)胞增殖；GAB2基因；miR-535；P13K/AKT信號通路

0 引言

【研究意義】顆粒細(xì)胞作為性索體細(xì)胞之一，與哺乳動物卵巢卵泡發(fā)育密切相關(guān)[1]。卵泡是卵巢的基本功能單位，由未成熟的卵母細(xì)胞及其周圍顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞組成[2]。卵泡的選擇、排卵和閉鎖等對卵巢功能具有重要影響[3]。卵泡發(fā)育是一個有序、周期性的過程，從靜止卵泡被激活到生長選擇成為優(yōu)勢卵泡的過程中，顆粒細(xì)胞起著重要的作用[4]。在卵泡發(fā)育的周期中，卵泡具有不同的生長階段，這些階段與促黃體生成素（FSH）的含量有關(guān)，在生長過程中，通常是最大的卵泡持續(xù)生長，其他卵泡逐漸閉鎖[5]。從原始卵泡到成熟卵泡的生長過程中，顆粒細(xì)胞通過與卵泡膜細(xì)胞直接聯(lián)系，分泌生長因子和激素，在滋養(yǎng)卵母細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的雌激素及其他內(nèi)分泌調(diào)節(jié)物質(zhì)，引發(fā)減數(shù)分裂、類固醇生成、卵泡發(fā)育、卵丘擴張、黃體化等卵母細(xì)胞過程，最終導(dǎo)致成熟排卵[7]。因此，顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡和分化成為卵泡發(fā)育的關(guān)鍵。排卵數(shù)又對產(chǎn)羔數(shù)起著決定性的作用，顆粒細(xì)胞的增殖決定了卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，進而影響卵母細(xì)胞排卵，影響產(chǎn)羔數(shù)?！厩叭搜芯窟M展】GRB2相關(guān)結(jié)合蛋白2（GRB2 associated binding protein 2, GAB2）是GRB家族蛋白的重要成員，介導(dǎo)PI3K信號通路和ERK信號通路調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育[8]。GAB2在N端含有一個Pleckstrin同源性（PH）結(jié)構(gòu)域，富含賴氨酸的基團和酪氨酸殘基，以磷酸化方式與GRB2-SRC同源結(jié)構(gòu)域（SH3）結(jié)合[9-10]。在GAB2中，兩個富含脯氨酸GRB2-SRC同源結(jié)構(gòu)域（SH3）的結(jié)合位點，通過SHC-GRB2復(fù)合物使GAB2與上游受體結(jié)合[11]。研究表明，GAB2可以參與調(diào)控細(xì)胞生長、遷移、分化和凋亡[12-14]。miRNA是長度為18—25 nt的短RNA分子，其主要功能是調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默[15]，影響相應(yīng)基因的表達，并對相應(yīng)的作用途徑進行調(diào)控[16]。miRNA在卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)控卵泡發(fā)育過程中起著重要作用[17-18]。已有研究指出miR-10a[19]、miR-130a-3p[20]、miR-21[21]、miR-1306[22]、miR-21-3[23]、miR-183-96-182[24]、miRNA17-9[25]、miR-21-3p[26]等均與卵巢顆粒細(xì)胞的增殖或凋亡相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】本團隊前期在高、低產(chǎn)羔數(shù)云上黑山羊卵巢組織RNA-seq中篩選出與山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)候選基因和可能存在的調(diào)控元件miR-535，并且和miR-535可能對顆粒細(xì)胞產(chǎn)生影響，但具體作用機制還未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以山羊顆粒細(xì)胞為研究對象，利用RT-qPCR、Western blotting、CCK8、EdU、雙熒光素酶試驗、免疫熒光和細(xì)胞凋亡試驗等驗證了mi-535與的調(diào)控關(guān)系，探討對山羊顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用及相關(guān)機制，為山羊分子育種提供靶點。

1 材料與方法

試驗時間為2022年12月至2023年3月，試驗地點為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室。

1.1 試驗樣品

云上黑山羊飼養(yǎng)于云南紅河哈尼族彝族自治州，選擇3周歲經(jīng)產(chǎn)、健康狀況良好且具有兩胎以上產(chǎn)羔記錄的云上黑山羊，根據(jù)產(chǎn)羔記錄分為高產(chǎn)組（3.00± 0.38/胎）和低產(chǎn)組（1.32±0.19/胎），同期發(fā)情處理45 h后，所有試驗羊飼養(yǎng)環(huán)境均相同。安樂死屠宰，收集新鮮卵巢組織，置于37℃生理鹽水（含2%雙抗（Penicilin-Streptomycin））中，運回實驗室。使用75%醫(yī)用酒精洗滌3次，37 ℃預(yù)熱的生理鹽水（含2%雙抗）洗滌3次。使用5 mL醫(yī)用注射器抽取卵泡直徑2—6 mm的卵巢卵泡，收集至15 mL離心管中。2 000 r/min離心5 min去上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)基（含2%雙抗）重懸，1 500 r/min離心5 min，去上清，重復(fù)2次。將獲得的細(xì)胞沉淀物加入10 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基（DMEM/F12﹕胎牛血清﹕雙抗=45﹕5﹕1），接種于5 cm2培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）。顆粒細(xì)胞密度達到85%以上，置于10 cm2培養(yǎng)皿中，同等條件培養(yǎng)，用于后續(xù)細(xì)胞試驗。HEK293T細(xì)胞從北京綠源博德公司購買所得。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶從Gbico（美國）公司購買所得；組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、CCK8檢測試劑盒、Edu檢測試劑盒、Western blotting所需分離膠、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、洗滌液和特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑等均從天根生化科技有限公司購買所得；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒從Invitrogen（美國）購買所得；反轉(zhuǎn)試劑盒和SYBR Green qPCR從Takara（日本）購買所得；雙熒光素酶活性測定試劑盒從Promega（美國）購買所得；Western blotting所需一抗和二抗均從Proteintech公司（美國）購買所得；全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒從北京索萊寶科技有限公司購買所得；其他均為常規(guī)化學(xué)試劑和常規(guī)耗材。

1.3 RNA提取和RT-qPCR

RNA的提取使用北京天根生化科技有限公司的動物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒，根據(jù)試劑說明書進行提取。提取完成后NanoDrop 2000（Thermo公司，美國）和1.2%瓊脂糖凝膠檢測RNA樣品的濃度和質(zhì)量。然后根據(jù)反轉(zhuǎn)試劑盒說明書獲得cDNA。以cDNA為模板，進行RT-qPCR。RT-qPCR的體系為20 μL：10 μmol·μL-1上下游引物各0.8 μL，10 mL SYBR Green qPCR，50 ng·μL-1cDNA 2 mL，6.4 μL ddH2O。qPCR程序為：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。以山羊為內(nèi)參基因。使用相對定量（2-△△CT）算法計算各基因的相對表達量。RT-qPCR的引物使用Primer 5軟件設(shè)計，由上海生工生物工程股份有限公司（中國）合成，序列如表1所示。

1.4 Western blotting

使用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白。收集培養(yǎng)好的顆粒細(xì)胞于1.5 mL離心管中，使用高速離心機4℃12 000 r/min下離心30 min，收集上清，棄沉淀。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定BCA，根據(jù)BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。按照蛋白體積：5×SDS Loading Buffer=4﹕1，將蛋白與5×SDS Loading Buffer混勻后金屬水浴鍋100 ℃煮沸8 min。每孔加入30 μg蛋白于BeyoGel Plus PAGE預(yù)制膠（Tris-Gly，10%，10孔），80 V，25 min；120 V 60 min，觀察溴酚藍(lán)膠底部即可停止。電泳結(jié)束后，使用150 mA 90 min電泳條件進行轉(zhuǎn)膜，隨后使用QuickBlock? Western封閉液搖床室溫封閉2 h。之后加入不同濃度的一抗4℃下?lián)u床封閉過夜，一抗稀釋濃度：GAB2（1﹕2000）；CCND2（1﹕2000）；CDK4（1﹕2000）；BAX（1﹕2000）；BCL2（1﹕2000）；AKT（1﹕2000）；Caspace3（1﹕2000）；PI3K（1﹕2000）；GAPDH（1﹕2000）。TBST洗滌5次，每次5 min。二抗（1﹕1000）室溫孵育2 h，二抗洗滌后使用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Odyssey CLX成像系統(tǒng)（Li-COR）曝光，拍照并保存。使用Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與GAPDH灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達水平。

表1 RT-qPCR所使用的引物序列

1.5 載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)miR-535的序列在上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成miR-535的模擬物（mimic）和抑制劑（inhibitor）。根據(jù)NCBI提供的序列，設(shè)計合成的過表達載體和干擾載體，過表達（pIRES2- EGFP-）和干擾（si-GAB2）載體在上海生工生物工程股份有限公司合成。

將山羊顆粒細(xì)胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞密度至70%—80%時，進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。棄培養(yǎng)基，加入2 mL PBS洗滌兩次。轉(zhuǎn)染6孔板的體系為：取242 μL Opti-MEM和8 μL Lipofectamine 2000試劑充分混勻配成A管。取230 μL Opti-MEM與20 μL 200 nmol·μL-1的載體（miR-535 mimic、miR-535 mimic NC、miR-535 inhibitor、miR-535 inhibitor NC、pIRES2-EGFP-、pIRES2-EGFP-NC、si-、si-NC，miR- 535 mimic+si-，miR-535 mimic+si-NC、miR-535 inhibitor+si-和miR-535 inhibitor+si-NC），充分混勻配成B管，靜置5 min。將B管加入A管，混勻后靜置20 min后加入6孔板中，之后加入1.5 mL的Opti-MEM。每組設(shè)置3個重復(fù)，轉(zhuǎn)染6 h后換為DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后檢測基因表達水平或細(xì)胞增殖效率。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測

根據(jù)NCBI提供的序列合成GAB2基因3′-UTR- WT 和3′-UTR-MUT（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）連接至psiCHECK2 載體，篩選陽性克隆并測序確認(rèn)后，與miR-535 mimic和mimic NC在共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞系中，培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min，每孔加入75 μL PBS重懸后，移至96 孔白色細(xì)胞培養(yǎng)板中。加入75 μL螢火蟲熒光素酶，采用多功能酶標(biāo)儀（MolecularDevices公司，美國）測定熒光值；加入75 μL內(nèi)參海腎熒光素酶后，測定熒光值。計算螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度/內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度（Firefly Luciferase/Renilla Luciferase）的比值。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

將山羊顆粒細(xì)胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞密度至70%—80%時，進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進行細(xì)胞凋亡實驗。轉(zhuǎn)染后的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PBS洗1次；使用4%多聚甲醛固定30 min，使用PBS洗滌1次；收集細(xì)胞，涂片，使細(xì)胞黏附在載玻片上；使用甲醛配置的0.3%過氧化氫溶液中室溫孵育20 min，PBS洗滌3次；使用免疫染色洗滌液（P0106），冰上孵育2 min，PBS洗滌1次；在載玻片上加50 μL生物素標(biāo)記液（TdT酶﹕Biotin-dUTP=1﹕24），37 ℃孵育60 min，使用PBS洗滌1次，滴加100 μL標(biāo)記反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，室溫孵育10 min；加入50 μL Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min；加入200 μL DAB顯色液，室溫孵育5 min；之后使用熒光倒置顯微鏡（德國徠卡公司）觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.8 Cell Counting Kit-8 （CCK8）

使用Cell Counting Kit-8 （CCK8），檢測顆粒細(xì)胞增殖情況。根據(jù)CCK8試劑盒說明書，以每孔2×103/100 μL的密度接種于96孔板，每組3個重復(fù)。根據(jù)試劑商說明書，轉(zhuǎn)染相關(guān)載體后分別在細(xì)胞生長0、6、12、24、48 h每孔加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)箱孵育2 h后使用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度，之后計算顆粒細(xì)胞增殖速率。細(xì)胞增殖活力計算：細(xì)胞活力（%）=[A(加藥)-A(空白)]／[A(0加藥)-A(空白)]×100[A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度，A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度，A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度]。

1.9 EdU分析

使用EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒，檢測顆粒細(xì)胞的增殖情況。根據(jù)EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書，將山羊顆粒細(xì)胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板，載體轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞狀態(tài)正常后等體積加入37 ℃預(yù)熱的EdU工作液（10 μmol·L-1），孵育3 h。EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1 mL固定液（免疫染色固定液，P0098），室溫固定15 min。洗滌液洗滌3次，每次5 min。去除洗滌液，每孔用1 mL通透液（免疫染色強力通透液，P0097）通透，室溫孵育15 min。去除通透液，加入1 mL洗滌液洗滌2次，每次3 min。封閉液室溫孵育20 min，洗滌液洗滌3次，每次2 min。每孔加入0.5 mL Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min，洗滌液洗滌3次，每次5 min。每孔加入200 μL Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min。洗滌液洗滌3次，每次2 min。熒光顯微鏡（德國，徠卡）下觀察并拍照記錄。

1.10 免疫熒光

山羊顆粒細(xì)胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板，每組3個重復(fù)。多聚賴氨酸處理爬片，置入6孔板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體培養(yǎng)48 h后取出。4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次3 min，10%山羊血清孵育30 min，適量GAB2抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，適量熒光IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI避光加入染細(xì)胞核5 min，PBS洗滌4次，每次5 min。熒光淬滅劑處理，樹脂膠密封載玻片，熒光倒置顯微鏡（德國，徠卡）觀察采集圖像。

1.11 統(tǒng)計分析

每個試驗3個生物學(xué)重復(fù)，使用SPSS 18.0（SPSS INC. Chicago，IL，USA）軟件進行統(tǒng)計分析。RT-qPCR和Western blot數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗分析，雙熒光素酶報告基因試驗通過單因素方差分析進行計算。**＜0.01，*＜0.05代表組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[27]。

2 結(jié)果

2.1 miR-535與GAB2在高、低產(chǎn)羔數(shù)云上黑山羊卵巢組織中的表達

為驗證本課題組前期云上黑山羊卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，使用RT-qPCR鑒定miR-535和在云上黑山羊卵巢組織中的表達量。結(jié)果表明，miR-535在高產(chǎn)云上黑山羊卵巢中的表達顯著低于低產(chǎn)云上黑山羊中的表達（＜0.05）（圖1-A）；在高產(chǎn)云上黑山羊卵巢中的表達量顯著高于低產(chǎn)云上黑山羊卵巢（＜0.05）（圖1-B）。這與本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

A. miR-535在高、低產(chǎn)羔數(shù)云上黑山羊卵巢組織中的mRNA表達；B. GAB2在高、低產(chǎn)羔數(shù)云上黑山羊卵巢組織中的mRNA表達。*P＜0.05；**P＜0.01。下同

2.2 GAB2促進山羊顆粒細(xì)胞增殖抑制其凋亡

為了探究對山羊卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用，分別過表達/干擾后檢測山羊顆粒細(xì)胞的增殖/凋亡情況。采用免疫熒光技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后GAB2蛋白的表達，過表達后，GAB2表達量顯著增多，干擾si-后，GAB2表達量顯著降低（圖2-A），表明過表達/干擾載體有效。RT-qPCR結(jié)果顯示過表達后，細(xì)胞周期相關(guān)基因、基因表達水平顯著上調(diào)（＜0.05），細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達水平顯著下調(diào)（＜0.05），的表達水平顯著上調(diào)（＜0.05），干擾后則相反（＜0.05）（圖2-B）。Western blot的結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致（圖2-C，D）。CCK8和EdU試驗結(jié)果表明，過表達顯著促進了顆粒細(xì)胞的增殖效率，而抑制的表達則相反（圖2-E，F(xiàn)）。細(xì)胞凋亡染色表明，過表達可顯著抑制顆粒細(xì)胞的凋亡；而抑制表達則促進了顆粒細(xì)胞凋亡（圖2-G）。這些結(jié)果表明，能夠促進山羊顆粒細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。

A. 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-及NC、si-及NC后，免疫熒光檢測GAB2的表達；B. 過表達/抑制后，、、、的mRNA相對表達量；C和D .過表達/抑制表達后，CCND2、CDK4、BCL2和BAX的蛋白表達水平和灰度值分析；E. 過表達/干擾表達后，EdU檢測顆粒細(xì)胞增殖； F.過表達/抑制表達后，CCK8檢測顆粒細(xì)胞增殖；G. 過表達/抑制表達后，細(xì)胞凋亡檢測顆粒細(xì)胞凋亡情況

A. Immunofluorescence detection of GAB2 expression after overexpression or inhibition of; B. Relative mRNA expression levels of,,andafteroverexpression or inhibition; C and D. The protein expression levels and gray value analysis of CCND2, CDK4, BCL2 and BAX after overexpression or inhibition of; E. EdU assay of granulosa cell proliferation after overexpression or inhibition of; F. CCK8 assay of granulosa cell proliferation after overexpression or inhibition of; G. Apoptosis detection of granulosa cell proliferation after overexpression or inhibition of

圖2促進山羊顆粒細(xì)胞增殖抑制其凋亡

Fig. 2promoted the proliferation of goat granulosa cells and inhibited their apoptosis

2.3 山羊miR-535靶向結(jié)合GAB2基因3’UTR

為了研究miR-535與之間的關(guān)系，通過在線軟件Target Scan和miRanda對結(jié)合位點保守性進行分析。結(jié)果顯示，預(yù)測的miR-535結(jié)合位點位于的3’UTR區(qū)（圖3-A）。將miR-535 mimics和miR-535 mimics NC與野生型和突變型的雙熒光素酶報告載體基因共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-535降低了野生型載體中的相對熒光素酶活性（＜0.05）（圖3-B）。在顆粒細(xì)胞中過表達miR-535后，的表達量顯著降低，而抑制miR-535表達后則相反（＜0.05）（圖3-C—E）。這些結(jié)果表明，在山羊顆粒細(xì)胞中miR-535可與的3’UTR區(qū)相結(jié)合，且miR-535直接靶向調(diào)控的表達。

A. miR-535和GAB2結(jié)合位點保守性預(yù)測；B. miR-535 mimics和GAB2 3’UTR區(qū)的雙熒光素酶活性檢測；C. miR-535過表達或抑制后GAB2 mRNA水平表達量檢測；D,E. miR-535過表達或抑制后GAB2 蛋白水平表達量檢測及灰度分析

2.4 miR-535抑制山羊顆粒細(xì)胞增殖促進其凋亡

為了探究miR-535對山羊卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用，將miR-535 mimics、miR-535 mimics NC、miR-535 inhibitor和miR-535 inhibitor NC轉(zhuǎn)染至山羊顆粒細(xì)胞，檢測其對山羊顆粒細(xì)胞增殖/凋亡的影響。使用RT-qPCR技術(shù)檢測了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后miR-535的mRNA相對表達量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-535 mimics后，miR-535的表達量顯著上調(diào)（＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-535 inhibitor后，miR-535的表達量顯著下調(diào)（＜0.05）（圖4-A），表明mimics/inhibitor載體有效。結(jié)果表明，過表達miR-535后，細(xì)胞周期相關(guān)基因、表達水平顯著下調(diào)，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達水平顯著上調(diào)（＜0.05），的表達水平顯著下調(diào)，抑制miR-535表達后則相反（圖4-B，C）。Western blotting與RT-qPCR的結(jié)果一致（圖4-D，E）。CCK8、EdU結(jié)果顯示，過表達miR-535后，顯著抑制了顆粒細(xì)胞的增殖能力；抑制miR-535表達后則相反（圖4-F，G）。細(xì)胞凋亡染色表明，過表達miR-535能夠顯著促進顆粒細(xì)胞的凋亡；抑制miR-535后則顯著抑制了顆粒細(xì)胞凋亡（圖4-H）。這些結(jié)果表明，miR-535可以顯著抑制山羊顆粒細(xì)胞的增殖，并促進其凋亡。

A. 轉(zhuǎn)染miR-535 mimics、miR-535 inhibitor及NC后，miR-535的mRNA相對表達量；B.過表達miR-535后，、、和的mRNA相對表達量；C. 抑制miR-535表達后，、、和的mRNA相對表達量；D和E.過表達或抑制miR-535后，CCND2、CDK4、BCL2和BAX的蛋白表達水平和灰度值分析；F. 過表達或抑制miR-535后，EdU檢測顆粒細(xì)胞增殖；G. 過表達或抑制miR-535后，CCK8檢測顆粒細(xì)胞增殖；H. 過表達或抑制miR-535后，細(xì)胞凋亡檢測顆粒細(xì)胞凋亡情況

A. Relative mRNA expression of miR-535 after transfection with miR-535 mimics, miR-535 inhibitor and NC;B. Relative mRNA expression levels of,,andafter miR-535 overexpression; C. Relative mRNA expression levels of,,andafter miR-535 inhibition; D and E. The protein expression levels and grayscale values of CCND2, CDK4, BCL2 and BAX after overexpression or inhibition of miR-535; F. Detection of granulosa cell proliferation by EdU after overexpression or inhibition of miR-535; G. Detection of granulosa cell proliferation by CCK8 after overexpression or inhibition of miR-535 granulosa cell proliferation; H. Apoptosis detection of granulosa cells after overexpression or inhibition of miR-535

圖4 miR-535抑制山羊顆粒細(xì)胞增殖并促進其凋亡

Fig. 4 miR-535 inhibited proliferation and promoted apoptosis in goat granulosa cells

2.5 GAB2拮抗miR-535的調(diào)控作用

為了進一步探究miR-535與是否存在靶向作用調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡。本研究將miR-535 inhibitor+siRNA、miR-535 inhibitor+siRNA NC和miR-535 inhibitor NC+siRNA共轉(zhuǎn)染于顆粒細(xì)胞中，miR-535 inhibitor NC+siRNA NC作為對照組，來驗證miR-535與基因的靶向調(diào)控關(guān)系。研究結(jié)果表明，與對照組（miR-535 inhibitor NC+siRNA NC）相比，同時抑制miR-535和不抑制GAB2的表達后，細(xì)胞周期相關(guān)基因、和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達水平顯著上調(diào)，的表達水平顯著下調(diào)（＜0.05）；抑制miR-535 的同時抑制后細(xì)胞周期相關(guān)基因、和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達水平顯著下調(diào)（＜0.05），細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達水平顯著上調(diào)（＜0.05）（圖5）。這些結(jié)果表明，山羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡確實受到了miR-535-通路的影響，miR-535與的表達存在拮抗作用。

圖5 GAB2拮抗miR-535的調(diào)控作用

2.6 miR-535靶向GAB2激活PI3K/AKT信號通路

根據(jù)生物信息學(xué)分析表明，作用于PI3K/ AKT信號通路。STRING分析結(jié)果表明，可與PI3K/AKT信號通路的標(biāo)志因子AKT1具有蛋白互作的關(guān)系（圖6-A）。因此推測，miR-535靶向調(diào)控激活PI3K/AKT信號通路影響顆粒細(xì)胞的生長。結(jié)果表明，過表達miR-535后，PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因的表達量顯著下調(diào)，而抑制miR-535后，PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因的表達量顯著上調(diào)（＜0.05）（圖6-B）。Western blotting結(jié)果與RT- qPCR結(jié)果一致（＜0.05）（圖6-C，D）。以上研究結(jié)果表明，miR-535靶向調(diào)控激活PI3K/AKT信號通路影響顆粒細(xì)胞生長。

3 討論

3.1 山羊miR-535和GAB2在卵巢組織中的表達

卵巢是雌性動物重要的繁殖器官，卵泡是哺乳動物卵巢行使功能的基本單位。從靜止卵泡被激活，到生長選擇成為優(yōu)勢卵泡的過程中，顆粒細(xì)胞起著重要的作用[28]。目前，關(guān)于山羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖的分子機制仍不清晰。研究發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p能夠促進顆粒細(xì)胞凋亡，抑制顆粒細(xì)胞增殖，刺激類固醇的分泌，從而影響山羊卵泡的發(fā)育[29]。在本課題組前期高、低產(chǎn)羔數(shù)云上黑山羊卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)相關(guān)候選基因和調(diào)控元件miR-535可能存在靶向關(guān)系，然而，其分子作用機制還有待研究。在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-535在云上黑山羊高產(chǎn)卵巢中高表達，在云上黑山羊高產(chǎn)卵巢中低表達，存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，與前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

3.2 miR-535抑制了山羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖

在哺乳動物的卵巢中，卵泡中的體細(xì)胞（顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞）在卵母細(xì)胞成熟和雌性生殖過程中起重要作用[30-31]。在卵泡排卵的過程中，顆粒細(xì)胞的數(shù)量決定著胚胎發(fā)育速率和卵母細(xì)胞的成熟[32]。miRNA作為基因表達過程中重要的調(diào)節(jié)因子，結(jié)合互補mRNA并抑制其表達[33]。在哺乳動物的卵巢中miRNA通過結(jié)合編碼基因的3’-UTR結(jié)合后，對編碼基因產(chǎn)生沉默作用，導(dǎo)致mRNA的翻譯停止[34]，如miR-324-3p[35]、miR-101-3p[36]、miR-130a-3p[20]等，但miR-535在山羊顆粒細(xì)胞中的作用還未被報道。有研究表明，miR-535的過表達改變了、和的表達，進而影響介導(dǎo)的冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)核心成分以及CBF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的冷應(yīng)激響應(yīng)標(biāo)記基因的表達，這說明miR-535可以調(diào)控基因功能[37]。在本研究中，miR-535抑制了卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，并降低了EdU陽性細(xì)胞數(shù)量。這表明miR-535可能是山羊顆粒細(xì)胞中重要非編碼RNA，值得深入探究其功能。

A. STRING分析與GAB2相關(guān)蛋白；B. 過表達或抑制miR-535后AKT1的mRNA相對表達量；C. 過表達或抑制miR-535后AKT1的蛋白表達水平；D. 過表達或抑制miR-535后AKT1的蛋白灰度值分析

3.3 GAB2促進了山羊卵巢顆粒細(xì)胞的增殖

作為重要的結(jié)合效應(yīng)蛋白，在眾多細(xì)胞因子的刺激下，磷酸化含有氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，將信號傳遞給小GTP酶，完成細(xì)胞信號傳遞，在細(xì)胞的生長發(fā)育等過程中產(chǎn)生重要作用[38]。目前眾多研究表明，miRNA可以靶向從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化。miR-197通過靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的抑制細(xì)胞增殖，抑制母細(xì)胞瘤的發(fā)展[39]；miR-663b通過調(diào)控對肝細(xì)胞癌起到抑制作用[40]；miR-218通過靶向抑制PI3K/AKT/mTOR/VEGFA通路，從而抑制腎細(xì)胞癌和血管內(nèi)皮因子[41]；但miR-535對的調(diào)控作用還未見報道。本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中存在可能作為miR-535的靶向mRNA對顆粒細(xì)胞起調(diào)控作用。使用雙熒光素酶活性報告驗證miR-535能夠與的3’UTR結(jié)合，證實miR-535與存在直接的靶向關(guān)系。顯著促進了細(xì)胞增殖因子和的表達，顯著抑制了凋亡因子且促進了的表達。并且促進了卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，并提高了EdU陽性細(xì)胞數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，能夠促進顆粒細(xì)胞增殖，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-535與之間的調(diào)控關(guān)系，且miR-535能夠抑制在顆粒細(xì)胞的表達。

3.4 miR-535對其他功能基因的影響

PI3K/AKT信號通路能夠參與細(xì)胞增殖、分化、自噬和凋亡等生理過程，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)過程中起重要作用[42]。作為PI3K/AKT信號通路中重要的標(biāo)志基因，在PI3K/AKT信號通路調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用。PI3K/AKT信號通路與顆粒細(xì)胞增殖或凋亡密切相關(guān)，在卵巢發(fā)育過程中，F(xiàn)SH與卵泡膜上的受體結(jié)合，激活上游蛋白激酶與，從而使下游靶基因和PI3K/AKT信號通路被激活[43]。這表明，可以通過PI3K/AKT途徑調(diào)控細(xì)胞的生長過程。雖然未在山羊中發(fā)現(xiàn)miR-535通過PI3K/AKT途徑調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖。但是在多個物種中發(fā)現(xiàn)miRNA可通過PI3K/AKT途徑調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖、自噬、凋亡和分化[44-47]。本研究發(fā)現(xiàn)可與PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵基因產(chǎn)生互作關(guān)系，并且過表達miR-535可顯著抑制的表達。因此推測miR-535-可能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控山羊顆粒細(xì)胞生長發(fā)育，但還需要進一步研究確認(rèn)其調(diào)控機制。

4 結(jié)論

本研究驗證了miR-535通過靶向調(diào)控的表達調(diào)控顆粒細(xì)胞，可能通過PI3K/AKT途徑促進顆粒細(xì)胞增殖。這些研究結(jié)果為解析山羊多羔性狀形成的分子機制及分子育種提供了新的見解。

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miR-535 Targets the GAB2 Gene to Promote Goat Granulosa Cell Proliferation Through Activation of the PI3K/AKT Signaling Pathway

WANG Peng, LIU ZiYi, LIU YuFang, CHU MingXing

Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Animal Biotech Breeding, Beijing 100193

【Background】MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules of 18-25 nt in length that play an important role in the regulation of follicle development in mammalian ovary granulosa cells (GCs). The previous sequencing of the transcriptome of the ovaries of high and low kidding individuals in Yunshang black goats showed that miR-535 was able to influence the kidding number of goats, but the specific regulatory mechanism was not yet clear. 【Objective】The aim of this study was to investigate the molecular mechanisms of miR-535 targeting the GRB2 associated binding protein 2 () and its associated signaling pathway PI3K/AKT affected the proliferation of goat GCs, so as to further investigate the molecular biological regulation mechanism. 【Method】In this study, three high- and low-fertility Yunshang black goats with the kidding number record of more than two litters were selected, and their follicular ovarian tissues were collected after synchronous estrus treatment for collecting primary GCs. The expression of miR-535 andvector was constructed and the effect of candidateon the proliferation of goat GCs was detected using RT-qPCR, Western blot, immunofluorescence, CCK8, EdU and Apoptosis, respectively. The prediction of the targeted relationship between miR-535 andwas performed with miRDB and miRanda software. The Wild-type and Mutant vectors ofwere constructed and the targeting relationship between miR-535 andwas detected by the dual luciferase activity assay. The overexpression/inhibitor miR-535 vector was constructed to explore the effect of its GCs proliferation and downstream gene function. 【Result】The RT-qPCR results showed that the expression ofwas significantly lower in ovarian tissues of Yunshang black goats with high-fertility than that in low-fertility groups, and the expression of miR-535 was the opposite (＜0.05). The results of RT-qPCR and Western blot showed that the expression of CCND2, CDK4 and BCL2 was significantly increased (＜0.05), while the expression of BAX was significantly decreased (＜0.05) after overexpression of＜0.05). Dual luciferase reporter assays showed that miR-535 inhibited dual luciferase activity in the 3'UTR region of the GAB2 gene. The results of RT-qPCR and Western blot showed that the expression of GAB2, CCND2, CDK4 and BCL2 in goat GCs was significantly decreased and the expression of BAX was significantly increased after miR-535 overexpression, while the opposite was true after miR-535 inhibition (＜0.05). Both EdU and CCK8 assays showed that miR-535 overexpression significantly inhibited the proliferation of GCs, while the opposite was true after miR-535 inhibition (＜0.05). Apoptosis assays showed that miR-535 overexpression promoted GCs proliferation and the opposite was true after inhibition of its expression. The expression levels of the PI3K/AKT signaling pathway marker AKT in goat GCs were significantly increased after inhibition of miR-535, respectively (＜0.05). 【Conclusion】In conclusion, the results of this study suggested that miR-535 inhibited the proliferation of goat granulosa cells by suppressing the expression of. These results provided a theoretical basis for further investigation of the biological functions of miR-535 regulating goat GCs.

goat kidding number; ovarian granulosa cell proliferation; GAB2gene; miR-535; P13K/AKT signaling pathway

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.23.016

2023-03-24；

2023-08-31

國家自然科學(xué)基金（32102509）、財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-38）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS- ZDRW202106和ASTIP-IAS13）

王鵬，E-mail：wp05223414@163.com。通信作者劉玉芳，E-mail：aigaiy@126.com。通信作者儲明星，E-mail：mxchu@263.net

（責(zé)任編輯 林鑒非）