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    苦參堿對人骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡影響的實驗研究

    2014-03-15 00:44:10李國慧劉瑞花李貴霞張麗霞張素領(lǐng)
    關(guān)鍵詞:電鏡苦參堿抗癌

    李國慧,劉瑞花,李貴霞,張麗霞,張素領(lǐng)

    (1.河北省兒童醫(yī)院檢驗科,河北 石家莊 050031;2.河北省老年病醫(yī)院藥劑科,河北 石家莊 050011)

    骨肉瘤是兒童和青少年常見的骨惡性腫瘤,盡管早期手術(shù)和輔助化療使得患者預(yù)后有明顯的改善,但目前仍有20%~40%患者死于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,對于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者,采用化療是惟一有效的治療方法,新輔助化療對提高骨肉瘤患者的5年生存率至關(guān)重要。相對于其他惡性腫瘤,治療骨肉瘤的化療藥物種類不多,而且目前供臨床使用的化療藥物效果都不太理想,因此篩選不良反應(yīng)小、治療療效高的抗癌藥物,已成為當(dāng)前熱門研究的課題。本研究運用電鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)探討苦參堿對人骨肉瘤細(xì)胞MG63誘導(dǎo)凋亡效應(yīng),并對促凋亡因子caspase-3產(chǎn)生量的變化進行檢測和分析,旨在進一步闡明苦參堿抗癌的作用機制,為臨床使用苦參堿抗癌治療提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞培養(yǎng):人骨肉瘤MG63細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實驗中心保存,提供使用。

    MG63細(xì)胞生長在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37℃飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。

    1.2 透射電鏡觀察:當(dāng)MG63細(xì)胞生長到80%匯合時,加入終濃度為0.2、0.4、0.6g/L含苦參堿的培養(yǎng)基,對照組加入不含苦參堿藥物的培養(yǎng)基,用藥物培養(yǎng)作用72h后,收集細(xì)胞,用PBS洗2次,然后用體積分?jǐn)?shù)2.5% 的戊二醛4℃固定2h,經(jīng)PBS洗滌2次;用10g/L鋨酸后固定,經(jīng)PBS洗滌2次;丙酮系列脫水;最后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋。KB-1型超薄切片機切片;醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色;在透射電鏡(日立H-7500,日本)下觀察并照相。

    1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:收集經(jīng)苦參堿作用72h的MG63細(xì)胞和對照組細(xì)胞,冷PBS漂洗3次。預(yù)冷70%乙醇4℃冰箱固定,上機檢測前離心去固定液,0.5%胃蛋白酶消化,碘化丙錠(50mg/L Trinton X-100 1.0%)室溫避光染色,流式細(xì)胞儀上機檢測,應(yīng)用軟件進行分析。

    1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測caspase-3蛋白的表達:收集經(jīng)苦參堿作用72h的MG63細(xì)胞及對照組細(xì)胞,按常規(guī)方法進行熒光標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測熒光強度,以熒光指數(shù)表示蛋白的表達情況。

    2 結(jié) 果

    2.1 電鏡觀察結(jié)果:電鏡下可見對照組MG63細(xì)胞表面有少許微絨毛,細(xì)胞體積較大,橢圓形,核大,不規(guī)則,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有線粒體,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),還有游離的核糖體(圖1A)。0.6g/L苦參堿干預(yù)MG63細(xì)胞72h后,電鏡下可觀察到瘤細(xì)胞體積變小,細(xì)胞表面微絨毛消失,細(xì)胞核染色質(zhì)凝集邊聚,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,細(xì)胞表面出現(xiàn)空泡(圖1B)。

    圖1 透射電鏡觀察結(jié)果

    A.對照組細(xì)胞(×15 000);B.0.6g/L苦參堿干預(yù)72h后的MG63細(xì)胞(×15 000)

    Figure 1 Morphological observation by transmission electron microscopy in MG63 cells

    A.Control cells(×15 000); B.Cells treated with 0.6g/L of matrine for 72h(×15 000)

    2.2 細(xì)胞凋亡情況:0.2、0.4、0.6g/L的苦參堿處理細(xì)胞72h后,G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰。MG63細(xì)胞凋亡率分別為(11.37±0.53)%、(14.28%±0.16)%、(24.59±0.23)%,與對照組細(xì)胞的凋亡率(3.27±0.11)%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。處理后各作用組的細(xì)胞G0/G1期比例增高,分別為(69.14±1.12)%、(75.31±0.33)%、(82.64±0.16)%,與對照組的(63.21±1.52)%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

    2.3 Caspase-3蛋白表達情況:0.2、0.4、0.6g/L苦參堿處理細(xì)胞72h后,caspase-3蛋白表達升高,MG63細(xì)胞的熒光指數(shù)分別為1.64±0.01、1.84±0.03、2.08±0.02,與對照組細(xì)胞熒光指數(shù)1.00±0.02比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

    3 討 論

    當(dāng)前惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增加,已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大殺手,對惡性腫瘤的防治成為醫(yī)務(wù)工作者面臨的重要課題。目前抗癌藥物的研究已逐漸轉(zhuǎn)向天然動植物,我國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥越來越受到人們的青睞??鄥A是從中藥苦參的干燥根中提取的一類活性物質(zhì),多年來的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)苦參堿毒性小,具有抗病毒、抗炎、抗肝纖維化、保肝降酶、升高白細(xì)胞、強心、降壓、抗心率失常、提高機體免疫力等作用[1-2],特別是抗癌作用的發(fā)現(xiàn),引起了人們的普遍關(guān)注[3-4]??鄥A治療骨肉瘤的研究尚處于起步階段。

    腫瘤發(fā)生不僅是由于瘤細(xì)胞的過度增生,還與瘤細(xì)胞死亡過少、凋亡機制障礙有關(guān)[5]。細(xì)胞凋亡參與腫瘤起始過程,并對腫瘤發(fā)生發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用[6]。本研究結(jié)果顯示,MG63細(xì)胞在經(jīng)苦參堿作用后,電鏡下呈早期凋亡的特征,細(xì)胞膜微絨毛消失,可見出芽現(xiàn)象,細(xì)胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞核染色質(zhì)凝集邊聚,最終細(xì)胞核崩解為碎片,并連同其周圍的胞漿共同形成許多凋亡小體。本研究流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,與對照組相比,隨著苦參堿藥物濃度的增加,G0/G1期占細(xì)胞周期的比例逐漸增加,同時發(fā)現(xiàn)苦參堿組細(xì)胞G1期前面出現(xiàn)亞二倍體的凋亡峰,0.2、0.4、0.6g/L的苦參堿作用細(xì)胞72h后,MG63細(xì)胞凋亡率分別為(11.37±0.53)%、(14.28±0.16)%、(24.59±0.23)%,呈遞增趨勢。表明苦參堿能顯著抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖,在阻滯細(xì)胞周期進程的同時誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    Caspase家族在細(xì)胞凋亡中具有重要作用,其中caspase-3最為關(guān)鍵,在正常情況下caspase-3以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時則轉(zhuǎn)化為有活性的caspase-3?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中有caspase-3的活化[7-11]。本研究利用流式細(xì)胞技術(shù)觀察到經(jīng)不同濃度苦參堿作用的MG63細(xì)胞中caspase-3蛋白逐漸升高。說明苦參堿作用MG63細(xì)胞過程中有caspase-3的活化,所以使苦參堿誘導(dǎo)MG63細(xì)胞的凋亡率增加。表明苦參堿誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡作用可能與促進caspase-3基因的表達活性增加有關(guān)??鄥A調(diào)控caspase-3基因表達的分子生物學(xué)機制尚有待進一步研究證實。

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