RP-HPLC測定注射液中甲硫酸新斯的明含量

蘇 亮，廖曉兵，何義剛，胡宇莉*

(1.重慶市獸藥飼料檢測所，重慶400120;2.waters科技(上海)有限公司，上海201206)

甲硫酸新斯的明是抗膽堿酯酶藥之一，通過抑制膽堿酯酶活性而發(fā)揮完全擬膽堿作用，還直接激動骨骼肌終板上煙堿樣受體［1］。甲硫酸新斯的明注射液在獸醫(yī)臨床上的應用較為廣泛。首先，它抑制膽堿酯酶的活性而出現(xiàn)擬膽堿樣作用，興奮胃腸平滑肌，可增強胃腸蠕動，促進食欲和反當;其次，它對生殖系統(tǒng)的選擇性興奮作用較強，能興奮子宮平滑肌，促進其中內(nèi)容物的排出，故常用于母畜的子宮內(nèi)膜炎、孕畜分娩困難、胎衣不下和和產(chǎn)后尿潴留等［2］;另外，甲硫酸新斯的明安全、副作用小，且來源廣，價格較便宜。因此，它在獸醫(yī)臨床上有較好的實用價值。《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版一部采用氮測定法測定甲硫酸新斯的明注射液的含量，該方法過程繁瑣，在實際檢測中較為耗時，且容易產(chǎn)生誤差。本試驗建立了準確、簡潔的RP-HPLC法對注射液中甲硫酸新斯的明含量進行測定。

1 儀器與試藥

e2695-2489高效液相色譜儀(美國waters公司);empower2.0色譜工作站(美國waters公司);甲硫酸新斯的明對照品(中國食品藥品檢定所，批號:100550-200401，含量:100.0%);甲硫酸新斯的明注射液樣品(批號:20130701，哈爾濱三馬獸藥業(yè)有限公司;批號:130801，重慶泰通動物藥業(yè)有限公司;批號:20131001，四川恒通動物制藥有限公司);甲醇為色譜純，磷酸和三乙胺為分析純，試驗用水為milli-Q純水機自制超純水。

2 方法與結果

2.1 對照品儲備液和對照品溶液的制備 取甲硫酸新斯的明對照品約20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為2 mg/mL的對照品儲備液，置4℃保存。精密量取對照品儲備液1 mL，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為40 μg/mL的對照品溶液。

2.2 波長選擇 取甲硫酸新斯的明對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，得出260 nm為甲硫酸新斯的明的最大吸收波長。所以，選擇260 nm作為該方法的測定波長。結果見圖1。

圖1 甲硫酸新斯的明的紫外光譜圖

圖2 空白(含輔料)溶液(A)、甲硫酸新斯的明對照品溶液(B)、甲硫酸新斯的明注射液樣品(C)HPLC圖

2.3 色譜條件 色譜柱:Thermo hypersil Gold-C18柱(美國 Thermo Fisher公司，4.6×150 mm，5 μm);流動相:0.1%磷酸水溶液(用三乙胺調(diào)pH至3.0)-甲醇(90∶10);流速1 mL/min;檢測波長260 nm;柱溫25 ℃;進樣量 10 μL。

2.4 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗 取空白輔料溶液、甲硫酸新斯的明對照品和樣品溶液按2.3項條件測定，甲硫酸新斯的明對照品和樣品溶液色譜峰的保留時間為7.48 min，理論塔板數(shù)不低于3000，拖尾因子小于1.02，空白輔料對測定無干擾，且相鄰位置無其他干擾峰。結果表明，方法的系統(tǒng)適應性和專屬性滿足檢測要求。結果見圖2。

2.5 線性關系考察 分別精密量取對照品儲備液0.1、0.5、2、5 mL 置100 mL 容量瓶中，1、2.5 mL 置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為 2、10、40、100、200、500 μg/mL 的系列對照品溶液。按2.3項下條件測定，以甲硫酸新斯的明的濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸分析，得回歸方程和回歸系數(shù)分別為:y＝11041x+12912，R2＝0.9999。結果表明，甲硫酸新斯的明在2～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 定量限和檢出限考察 分別精密量取甲硫酸新斯的明注射液(規(guī)格1 mg/mL)樣品適量，加水逐級稀釋，搖勻，得到濃度分別為 1、2、3、4、5 ng/mL的樣品溶液，按2.3項條件測定。以S/N＝3、S/N＝10分別作為甲硫酸新斯的明的檢出限和定量限判定標準，結果表明，本方法的檢出限和定量限為分別為1 ng/mL和2 ng/mL。

2.7 樣品含量測定方法 精密量取甲硫酸新斯的明注射液2 mL(規(guī)格1 mg/mL)，置50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液。取該溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另取40 μg/mL的甲硫酸新斯的明對照品溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。理論塔板數(shù)按甲硫酸新斯的明峰記應不低于3000。

2.8 精密度試驗 取供試品溶液6份，按2.3項條件平行測定6次，得RSD＝0.5%。結果見表1。表明本方法精密度符合要求。

表1 甲硫酸新斯的明的精密度試驗結果 n＝6

2.9 準確度試驗 取適量的甲硫酸新斯的明對照品9份，精密稱定(稱樣量分別為8.01 mg、8.01 mg、8.02 mg、10.01 mg、10.01 mg、10.01 mg、12.01 mg、12.01 mg、12.03 mg)，置 10 mL 容量瓶中。每3份一組，分別加入空白輔料溶液，稀釋至刻度并搖勻，得到相當于注射液標示量的80%、100%、120%的樣品溶液。按2.3項條件測定，計算回收率，結果見表2。結果顯示，高中低濃度供試品溶液的平均回收率范圍為100.2% ～100.8%，RSD范圍為0.7% ～1.2%，表明本方法準確度符合要求。

2.10 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、3、6、10、12、24 h 迸樣，按 2.3 項下條件測定其峰面積，計算峰面積的RSD值，RSD＝2.46%，結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 樣品測定 分別精密量取甲硫酸新斯的明注射液2 mL，按2.7項方法操作，并按2.3項條件測定其含量。結果見表3。

表2 甲硫酸新斯的明的回收率結果

表3 樣品含量測定結果n＝2

3 討論與小結

3.1 《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版一部采用氮測定法測定注射液中甲硫酸新斯的明的含量［3］。該方法有以下缺陷:到達滴定終點時，消耗滴定液的量僅為2～3 mL，滴定液消耗體積過小是結果誤差產(chǎn)生的重要來源;要求配備專用儀器半微量氮測定儀;檢測過程長，僅消化一項就需要耗時2～3 h，若沒有可調(diào)溫消解儀，則消化過程更長更繁瑣;注射液的藥物含量低，終點時指示劑變色不明顯［4］;另外，檢測中使用到的檢測試劑種類也比較多。高效液相色譜法用于獸藥含量檢測，具有較高的靈敏度和分離度，前處理過程也比較簡單，檢測周期較短。本試驗所建立的方法中，樣品僅用水稀釋定容即可上機檢測，且流動相易于配制。方法精密度RSD＝0.5%，平均回收率范圍為100.2% ～100.8%，檢測定量限達到2 ng/mL，樣品主峰無雜質(zhì)干擾。

3.2 在以往報道的液相方法中，檢測甲硫酸新斯的明的流動相中多含有磷酸二氫鹽及庚烷磺酸鈉［5-6］。前者容易在液相流路中析出，造成堵塞和儀器部件磨損;后者會對C18柱造成不可逆的損傷。本試驗中采用磷酸和三乙胺配制流動相，得到了滿意的色譜峰形和重現(xiàn)性，克服了前述不足。同時，由于甲硫酸新斯的明分子易與C18柱的硅醇基相互作用形成拖尾，所以，調(diào)節(jié)流動相pH至3，可以抑制硅醇基的影響，減輕拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生。另外，本試驗使用了長度為150 mm的色譜柱，將主成分的出峰時間控制在10 min之內(nèi)。與傳統(tǒng)的250 mm色譜柱相比，短柱更加節(jié)約人工、時間和試劑。使用短柱或者從其他角度(比如使用小粒徑的柱子)來提高獸藥檢測的分析效率，這一點在工作量日益增大的獸藥檢測實驗室中，顯得異常重要。

本試驗所建立的RP-HPLC，準確、穩(wěn)定、易于操作，可用于甲硫酸新斯的明注射液的質(zhì)量控制。

［1］佟 玲，譚曉杰，陳曉輝，等.RP-HPLC測定明鋅素滴眼劑中甲硫酸新斯的明的含量［J］.中國藥學雜志，2005，40(15):1182-1183.

［2］鄭四清.新斯的明在豬病臨床中的應用［J］.獸醫(yī)導刊，2009，(148):43-50.

［3］中國獸藥藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版一部［S］.

［4］王 偉，孫為德.間接原子吸收光譜法測定甲基硫酸新斯的明［J］.分析試驗，2003，22(4):62-63.

［5］岳昌林，毛黎靜，郭 忠.RP-HPLC測定注射用甲硫酸新斯的明含量的方法學研究［J］.藥物分析雜志，2005，25(10):1264-1265.

［6］唐琦文，江 峰，蔣國勝.高效液相色譜法測定復方新斯的明滴眼液中甲硫酸新斯的明的含量［J］.中國藥師，2006，9(10):942-943.