低共熔溶劑提取多糖的研究進展

蔡樹蕓，陳雅鑫，何裊裊，施麗君，張怡評*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（福州 350108）；2.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心（廈門 361005）

多糖一般是從自然植物、動物或者微生物中獲取的天然代謝產(chǎn)物。多糖可以被當(dāng)作原料或添加劑，已在食品、保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)提取多糖的方法，大多是以水為溶劑，存在提取時間長、活性組分易損失、提取效率較低、消耗的溶劑量大等缺點。因此，尋找能夠提高得率及提取效率的新型綠色溶劑成為倍受關(guān)注的問題。

在秉持著安全環(huán)保的概念下，越來越多的綠色提取溶劑出現(xiàn)，早在2003年就有研究者發(fā)現(xiàn)在一定條件下將氯化膽堿和尿素混合，其可以通過氫鍵締合作用形成一種透明的液體，并稱其為低共熔溶劑（Deep eutectic solvent，DES），該溶劑具有高效性、可降解、無污染性等特點[1]，可以溶解多種物質(zhì)，包括多糖、生物堿[2]、黃酮類[3]等，從而受到很多研究者的關(guān)注，將其應(yīng)用在中藥有效成分的提取中。文章簡單地對低共熔溶劑的性質(zhì)、分類和多糖的作用以及在提取多糖等方面的應(yīng)用進行介紹。

1 低共熔溶劑的性質(zhì)

1.1 熔點

在大多數(shù)情況下，當(dāng)氫鍵供體（hydrogen bond donator，HBD）和氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，HBA）混合時形成的混合物的熔點要低于其組成的任一成分。其熔點一般在150 ℃以下，大多數(shù)在室溫到70 ℃的范圍內(nèi)，且形成的液體狀態(tài)穩(wěn)定[4]。低共熔這一性質(zhì)主要與氫鍵之間的締合作用有關(guān)，且作用越強，混合物熔點就越低[5]。低共熔溶劑的熔點還會受到組成成分的種類[6]、氫鍵結(jié)構(gòu)以及組分摩爾比等因素影響[7]。

1.2 導(dǎo)電性

在電化學(xué)應(yīng)用中，溶劑的電導(dǎo)率對其具有重要作用。低共熔溶劑與離子液體相似，同樣具有較高的電導(dǎo)率。其導(dǎo)電性是由于陰陽離子之間的移動傳輸電荷，或是體系內(nèi)氫鍵的電子移動傳輸電荷。DES的電導(dǎo)率還會受到溫度的影響，當(dāng)溫度升高時，電子的傳輸效率就會越快，使電導(dǎo)率升高[8]。

1.3 黏度

低共熔溶劑的黏度主要是由范德華力和氫鍵決定[9]，溶劑黏度對化學(xué)成分的提取效率會產(chǎn)生一定影響，通常在室溫下DES的黏度較大，可能是因為離子間產(chǎn)生范德華力或靜電作用，或者是溶劑中離子體積較大和空穴體積較小的原因，導(dǎo)致低共熔溶劑的黏度變大。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對DES的黏度也有影響，隨著溫度的升高其黏度變小，因此，可以通過加熱來改變?nèi)軇┑酿ざ取?/p>

1.4 溶解性

低共熔溶劑的溶解能力和范圍廣泛，可以溶解多種生物大分子、金屬化合物等。唐蘭芳等[10]研究含水量為30%、氯化膽堿與尿素摩爾比1∶2的DESs提取黃精多糖，結(jié)果表明提取率高達28.50%，是傳統(tǒng)熱水提取的3.40倍。Abbott等[11]采用氯化膽堿與尿素的摩爾比為1∶2對金屬氧化物在DES中的溶解性進行研究，發(fā)現(xiàn)在DES中CuO、ZnO、PbO2的溶解度更大。

1.5 含水量

兩種低共熔組分之間存在強烈的氫鍵相互作用，適當(dāng)?shù)暮磕軌蚪档腿軇┑酿ざ?，從而增加其對提取物的溶解度，且可以使有些低共熔溶劑的電?dǎo)率增加。但在含水量到達50%（V/V）時氫鍵之間的相互作用逐漸減弱，因此在提取化學(xué)成分時應(yīng)當(dāng)考慮低共熔溶劑的含水量的影響[12]。

2 低共熔溶劑的分類

低共熔溶劑大致可以分為四類[13]，分別是季銨鹽與氫鍵供體、季銨鹽與金屬鹽、季銨鹽與含水金屬鹽、金屬鹵化物與氫鍵供體。

由季銨鹽和氫鍵供體組成的低共熔溶劑最為常用，其原理一般是季銨鹽中陰離子與氫鍵供體之間的氫鍵相互作用，而產(chǎn)生的熔點降低。氫鍵供體的種類主要包括多元醇、羧酸和酰胺類物質(zhì)。季銨鹽與金屬鹽以及季銨鹽與含水金屬鹽這兩類溶劑的形成主要是由于金屬鹽的陰離子X-與配位體Y通過共價鍵形成了電荷離域，導(dǎo)致熔點降低。金屬鹵化物與氫鍵供體形成的低共熔溶劑的反應(yīng)原理是金屬鹵化物在氫鍵供體經(jīng)過不對稱分裂形成金屬陽離子和金屬陰離子，通過配位原子與陽離子產(chǎn)生絡(luò)合，使電荷密度降低，從而達到共熔。有研究結(jié)果表明ZnCl2與尿素、乙二醇和1,6-己二醇可以形成低共熔混合物[14]。

3 多糖的作用

3.1 免疫調(diào)節(jié)

有大量研究表明，多糖對免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用[15]。舒翔等[16]將苦丁茶冬青多糖作用于體外培養(yǎng)的小鼠脾臟淋巴細胞，以TNF-α、IFN-γ和IL-1β分泌水平及脾臟淋巴細胞體外增殖能力為主要指標(biāo)，測定不同濃度的苦丁茶冬青多糖對正常小鼠脾臟淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，其研究結(jié)果表明苦丁茶冬青多糖確實可以促進誘導(dǎo)炎性細胞因子分泌和小鼠脾臟淋巴細胞增殖等作用促進免疫調(diào)節(jié)。田陽等[17]表明了枸杞子多糖進入體內(nèi)循環(huán)的機制，可以促進巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞、T細胞和B細胞等免疫細胞增殖，還可以增強巨噬細胞的吞噬能力，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。還有研究者發(fā)現(xiàn)裙帶菜多糖能夠顯著促進RAW264.7細胞增殖能力和胞飲能力，對TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的mRNA表達有顯著影響[18]。

3.2 抗氧化

過氧化氫和羥基自由基等活性氧會對細胞和組織造成損傷，導(dǎo)致衰老或者疾病的發(fā)生，因此抗氧化是研究的一大熱點。Lou等[19]從馬尾藻中分離純化出一種新型的多糖STSP-I，通過試驗發(fā)現(xiàn)與維生素C相比，該多糖清除自由基的作用更強。Fang等[20]用酶將龍須菜多糖降解為低分子量多糖，并對它們的抗氧化能力進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降解后的多糖的抗氧化活性有顯著提高。王猛等[21]采用H2O2對秀麗隱桿線蟲建立急性氧化應(yīng)激動物模型，以線蟲壽命、年齡色素及氧化應(yīng)激等為試驗指標(biāo)，研究褐藻多糖的抗氧化作用，其研究結(jié)果表明，褐藻多糖可以調(diào)控相關(guān)基因的表達，抑制氧化應(yīng)激水平，從而發(fā)揮對線蟲氧化損傷的保護作用。

3.3 降血糖

大部分中藥多糖具有降血糖功效，因此在臨床上常與治療糖尿病的藥物聯(lián)合使用。Luo等[22]研究葛根多糖對糖尿病db/db小鼠的作用機制，結(jié)果表明葛根多糖可以激活PI3K/AKT 信號通路，改善葡萄糖代謝，從而發(fā)揮治療糖尿病作用。Zhong等[23]采用微波輔助提取裙帶菜多糖，制備了三份硫酸化多糖，通過體外試驗發(fā)現(xiàn)可以提高胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖攝取。通過體內(nèi)研究試驗發(fā)現(xiàn)這些多糖可以增加葡萄糖耐量、降低空腹血糖水平并且還減輕胰島素抵抗。

3.4 降尿酸

高尿酸血癥是一種代謝性疾病，血液中的尿酸含量過高會形成尿酸結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)內(nèi)，導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)生。黃嘌呤氧化酶XOD是肝臟中嘌呤代謝的關(guān)鍵酶，可以將嘌呤催化為尿酸，可以通過降低XOD的活性從而達到降尿酸的作用。枸杞多糖可以抑制肝臟黃嘌呤氧化酶和促進腎臟尿酸排泄，預(yù)防小鼠的高尿酸血癥[24]。焉翠蔚等[25]通過體外試驗證實了海帶多糖可以抑制黃嘌呤氧化酶，從而減少尿酸的生成。

4 低共熔溶劑在提取多糖的應(yīng)用

低共熔溶劑是一種綠色的新型萃取溶劑，是由不同的氫鍵受體和氫鍵供體組成。因其安全性高、可生物降解且成本低等優(yōu)點，被應(yīng)用在生物堿、多糖、黃酮類和酚酸等多種有效成分的提取上[26]。文章主要對低共熔溶劑提取多糖的應(yīng)用進行闡述。

提取方法對天然藥物中多糖的提取率和生物活性有較大的影響[27]。因此，不斷優(yōu)化多糖的提取工藝對多糖未來的研究和開發(fā)利用具有重要意義。常見的多糖提取方法有熱水提取、超聲波輔助提取、超高壓提取、超臨界萃取和酶輔助提取等[28]，但不同的提取方法都會對提取的多糖的含量有不同的影響，且有些方法還存在成本高、操作難度大、提取效率低等缺點。近期有數(shù)據(jù)表明低共熔溶劑從植物中提取多糖比傳統(tǒng)提取溶劑具有更高的提取率，具有良好潛力[29]。梁靜[30]設(shè)計了19種低共熔溶劑對鐵皮石斛多糖進行提取并對其生物活性進行評價，以水提為對照組，發(fā)現(xiàn)低共熔溶劑對多糖的提取率要高于水提，且可應(yīng)用于大規(guī)模提取。劉旭等[31]研究在不同條件下采用低共熔溶劑對雞頭黃精進行提取，得到的黃精多糖提取率相較于傳統(tǒng)的水提醇沉法更高。其中在70 ℃提取條件下的黃精多糖提取率較其他試驗條件更高。Guo等[32]比較了不同提取方法對甜茶多糖的提取率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱水加壓和低共熔溶劑輔助提取的粗多糖獲得率相對于其他提取方法高。還有學(xué)者表明低共熔溶劑在多糖溶解和提取過程中發(fā)揮顯著作用，并且闡述了溶劑和多糖之間的相互作用機制，為低共熔溶劑提取多糖提供參考[33]。Nie等[34]研究氯化膽堿∶1,2-丙二醇組成的DES對可食用銅藻中的多糖超聲輔助提取的方法，得到最佳萃取條件：氯化膽堿與1,2-丙二醇的摩爾比為1∶2、含水量為30%（V/V）、固液比為1∶30 g/mL、萃取溫度為70 ℃。且研究還發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的熱水提取方法相比，使用DES提取的粗多糖中的蛋白質(zhì)含量更少，表明DES提取的多糖純度更高。熊蘇慧等[35]對低共熔溶劑提取千斤拔多糖的工藝進行優(yōu)化，篩選出氯化膽堿和1,3-丁二醇合成的DES對千斤拔多糖的提取最合適，采用響應(yīng)面法測定多糖的提取率，與水提醇沉法相比，DES的多糖提取率更高，可達2.47%。

5 低共熔溶劑提取多糖的機理

低共熔溶劑大致可以分為三類萃取分離的方式[36]：第一類是低共熔溶劑直接對化學(xué)成分萃取分離；第二類是形成低共熔溶劑的締合萃取分離；第三類是低共熔溶劑的分解達到萃取。天然有效成分大多都是第一類萃取方式[37]，就是先將HBA和HBD混合形成低共熔萃取劑，然后將目標(biāo)物通過液液萃取的方式提取出來。Zhang等[38]用氯化膽堿和1,4-丁二醇組成的低共熔溶劑直接用于提取山藥多糖，采用響應(yīng)面法優(yōu)化條件，得出含水量32.89%（V/V）、溫度94 ℃、提取時間44.74 min最佳，且比熱水提取和超聲輔助水提的提取率更高。

6 影響低共熔溶劑提取的主要因素

6.1 提取溫度

不同的溫度對多糖的得率會產(chǎn)生影響，往往會采用單因素分析篩選出適宜的提取溫度。有研究表明，適當(dāng)?shù)靥岣邷囟葧档偷凸踩廴軇┑酿ざ?，從而增加溶劑的溶解度[39]。張錦鈺[40]在60～90 ℃之間對淮山多糖進行提取，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高多糖的得率增大。何瑞陽等[41]對玉竹多糖的提取工藝進行優(yōu)化，通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，多糖的提取率隨著溫度的升高不斷增大，但當(dāng)提取溫度超過90 ℃以后多糖提取率出現(xiàn)了下降的趨勢，可能是高溫影響了低共熔溶劑的黏度，或者使多糖降解等。

6.2 溶劑類型

低共熔溶劑的組成對多糖提取率會造成影響。謝苗等[42]在5種不同組合的溶劑中篩選出對靈芝多糖提取率最高的低共熔組合，為氯化膽堿-尿素摩爾比為1∶2，并測定了其DPPH自由基清除率提高了20.50%。分別以不同有機酸、醇和尿素與氯化膽堿混合，組成9種不同的DESs溶劑提取螺旋藻中的多糖，試驗發(fā)現(xiàn)氯化膽堿和1,4-丁二醇（摩爾比為1∶4）組成的溶劑提取多糖效果最佳[43]。

6.3 提取工藝

單單使用低共熔溶劑對有效成分進行提取的效果會優(yōu)于傳統(tǒng)熱水提取，但是提取率還是有部分不完全，因此對提取工藝進行優(yōu)化使多糖提取更完全，有研究應(yīng)用超聲、微波輔助等方法結(jié)合低共熔溶劑，得到的多糖含量確實會高于僅使用低共熔溶劑提取。孫悅[44]采用微波輔助低共熔溶劑對鷹嘴豆中的多糖進行提取，對微波功率和微波時間進行考察，發(fā)現(xiàn)微波時間對多糖提取影響較大。超聲是提取工藝上常用的一種輔助手段，孫悅等[45]采用超聲輔助低共熔溶劑提取甘草多糖，通過響應(yīng)面試驗，研究了超聲功率、超聲時間與各試驗條件的交互作用，得出了最佳條件：料液比1∶50（g/mL）、溫度39 ℃、超聲功率250 W、超聲時間30 min，此時甘草多糖的提取率為8.31%。

7 結(jié)語與展望

低共熔溶劑具有易制備、無毒、生物相容性高、提取率高和經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于有效成分提取分離、油品的精制等領(lǐng)域。低共熔溶劑在提取多糖方面的研究越來越深入，證實其可以提高多糖的提取率，且所提取的多糖DPPH自由基清除率顯著提高，為多糖的提取方法提供選擇。但目前低共熔溶劑還處于發(fā)展階段，其種類和應(yīng)用范圍具有局限性，且DES會出現(xiàn)高黏度和糊狀稠度[46]的情況，導(dǎo)致提取效率下降。因此，需要對低共熔溶劑進一步深入研究，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。