真菌胞內(nèi)多糖提取方法的研究進展

阿燕

(包頭輕工職業(yè)技術(shù)學院乳品工程系，內(nèi)蒙古包頭014035)

真菌多糖系真菌中分離出的由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的不溶于高濃度乙醇、正丁醇及丙酮等有機溶劑的高分子聚合物，是從真菌子實體、菌絲體及發(fā)酵液中分離出的代謝產(chǎn)物。大量藥理實驗表明，真菌多糖可以消除體內(nèi)的自由基，具有抗氧化性，因而具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性，己被廣泛應用于醫(yī)療保健領域［1］。到目前為止，已有300余種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離出來，其中從中草藥、食藥用菌中提取的水溶性多糖最為重要。專家預測，隨著對多糖結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究，將會產(chǎn)生生物學的新領域，促進醫(yī)學上的高速發(fā)展和工農(nóng)業(yè)上新的應用［2］。國內(nèi)外在真菌多糖的研究及開發(fā)利用方面的進展很快，其中真菌多糖的提取是研究與應用的基礎。真菌多糖的提取過程就是使之從細胞內(nèi)釋放、穿過基質(zhì)、擴散到溶劑中的過程。本文對近年來國內(nèi)外報道的有關(guān)真菌胞內(nèi)多糖(菌絲體多糖和子實體多糖)的提取方法進行了概述，總結(jié)了幾種提取方法的優(yōu)勢與不足，為真菌多糖的提取應用提供參考。

1 熱水浸提法

大多數(shù)真菌多糖可溶于水，在熱水中呈黏液狀，在乙醇等有機溶劑中形成沉淀，因此熱水提取法是目前最常用的提取真菌多糖的方法。用熱水進行提取，主要是借助于熱力作用使食用菌細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，水作為溶劑滲入細胞壁和細胞質(zhì)中，溶解液泡中的物質(zhì)，使其穿過細胞壁，擴散到外部溶劑中［3］。史琦云等［4］總結(jié)歸納了食用菌多糖提取工藝流程：原料→烘干至恒重→粉碎→準確稱量→復水→熱水浸提→離心分離→上清液脫色→去除蛋白質(zhì)→醇析→離心→干燥→菌多糖成品。

隨著生物學與統(tǒng)計學、計算機科學等學科的交叉發(fā)展，目前一些統(tǒng)計學的設計方法和數(shù)據(jù)分析法已經(jīng)廣泛應用于真菌胞內(nèi)多糖提取，其中最常見的有正交試驗設計和Box-Behnken中心組合實驗設計。陳凌華等［5］對靈芝多糖熱水浸提過程中浸提的溫度、時間及料水比3個因素進行正交試驗，結(jié)果表明，浸提溫度對多糖得率的影響較大。靈芝多糖熱水浸提的優(yōu)化條件：溫度78℃，料水比1∶30(g/mL)，提取時間3 h，在此條件下單次浸提即可獲得絕大部分的子實體多糖。魏楨元等［6］以浸提時間、浸提溫度和料液比為影響因素，在單因素實驗的基礎上，應用Box-Behnken中心組合實驗方法進行3因素3水平的實驗設計，結(jié)果表明，熱水浸提香菇多糖的最佳工藝條件：浸提溫度78.6℃，浸提時間120 min，料液比1∶58.3(g/mL)，在此條件下的多糖得率和含量分別為14.22%和38.57%。熱水浸提法的優(yōu)點為試驗設備簡單，操作方便，提取成本低，適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，但此法存在的不足是需經(jīng)多次浸提，而且費時費料，勞動強度大，過長的浸提時間還會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，進而導致其生物活性的降低。

隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，一些改進的熱水浸提法開始應用于真菌多糖的提取。劉美娜等［7］利用加壓水提法對黑木耳子實體多糖提取過程進行了優(yōu)化，得出子實體多糖的最佳條件：浸提時間為90 min，料水比為1∶35(g/mL)，浸提溫度為115℃，提取率7.1 g/100 g。結(jié)果表明，在浸提時間、溫度、料水比相同的條件下，加壓水提法的多糖提取率較高，升高壓力有利于縮短提取時間，且對多糖本身沒有破壞作用，相比熱水浸提法有利于保持多糖的穩(wěn)定性，防止多糖在提取的過程中發(fā)生水解，也可以防止多糖失活。

亞臨界水提法也是當前興起的一種多糖提取方法，所謂亞臨界水也被稱為過熱水、高壓熱水或熱液態(tài)水。當水在374.2℃和22.1 MPa以上的高溫、高壓條件下，可形成既非液體又非氣體的第4狀態(tài)，即所謂“超臨界狀態(tài)”。在此狀態(tài)下的水稱為“超臨界水”。在稍微低于此溫度和壓力下的水稱為“亞臨界水”［8］。婁冠群等［9］采用亞臨界水技術(shù)提取香菇子實體多糖，結(jié)果表明，最佳提取條件為亞臨界水溫度150℃，料液比1∶30(g/mL)，浸提時間為5 min，浸提次數(shù)為2次，在該條件下香菇多糖得率可達15.7%，與熱水浸提法香菇多糖得率9.34%相比有很大提高，這是因為亞臨界水具有“強烈的溶解有機物在水中”和“強烈的分解力”等普通水不具有的性質(zhì);亞臨界水法的液料比小于熱水浸提法，這使提取液中香菇多糖的濃度增大，為后續(xù)濃縮和純化提供了方便。亞臨界水提取香菇多糖比熱水浸提法省時節(jié)能，具有較高的效率，實際生產(chǎn)中有較高的使用價值。

2 酸提法

酸提法一般適用于酸溶性多糖的提取，但時間宜短，溫度不宜過高。吳亞林等［10］采用0.05 mol/L的醋酸緩沖液(pH=6.0)提取冬蟲夏草菌絲體多糖，得率為1.84%。郝強［11］采用酸浸提法提取香菇多糖，以酸濃度、料液比、浸提時間、浸提溫度和加醇比為影響因素，通過五元二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設計，確定出優(yōu)化的主要工藝條件是酸濃度0.16～0.23 mol/L、料液比1∶36～1∶49(g/mL)、浸提時間2.7～3.8 h、浸提溫度50～67.8℃、加醇比1∶2～1∶3，4℃醇沉12 h。浸提1次提取多糖得率為7.61%，浸提2次提取多糖得率可達13.56%。五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗表明，5個因素對多糖提取率影響大小依次為浸提溫度、料液比、酸的濃度、浸提時間、加醇比，其中浸提溫度、料液比、酸的濃度、浸提時間呈現(xiàn)顯著性，而加醇比呈現(xiàn)不顯著。由于酸提法對多糖的糖苷鍵具有一定的破壞作用，降低多糖的提取率，因此，采用酸提法時，應選擇適宜濃度的酸溶液，以防止多糖的降解。

3 堿提法

堿提法一般適用于堿溶性多糖的提取，堿液能夠使真菌細胞和細胞壁充分吸水脹膨而破裂，從而促進真菌多糖的釋放，提高多糖提取率。陳建旭等［12］以赤靈芝為原料提取堿溶性多糖，比較了浸提時間、溫度、NaOH濃度、液料比及提取次數(shù)對堿溶性多糖提取率的影響，并以浸提時間、溫度、NaOH濃度以及液料比為考察因素，采用RSA響應面分析法，確定了堿溶性多糖提取的最佳工藝參數(shù)，即液料比20 mL/g，浸提溫度60℃，浸提時間2 h，NaOH質(zhì)量濃度5%，在此優(yōu)化工藝條件下，堿溶性多糖提取率為19.61%。劉華晶等［13］提取蛹蟲草菌絲體粗多糖時，用水和堿溶液2種溶劑分別進行提取試驗，利用正交旋轉(zhuǎn)設計軟件包計算從而找到多糖最佳提取條件，結(jié)果表明利用堿溶液進行提取所得多糖產(chǎn)量顯著高于水提取法。由此可見，采用堿提法提取真菌胞內(nèi)多糖具有提取效率高、能耗少、時間短等優(yōu)點，但是堿提后的溶液濃度增大，還需中和，后處理程序繁瑣。

4 酶提法

酶提法是通過酶反應將原料組織分解，以除去細胞壁和膜上的果膠、纖維素及蛋白質(zhì)等成分，從而降低提取難度，有利于細胞壁內(nèi)多糖的溶出，使多糖提出率提高［14］。酶解法的一般方法為按一定料液比加入樣品干粉和生物酶、蒸餾水，在合適溫度和pH值下酶解一定時間，然后升溫滅酶，在合適的溫度下提取一定時間，離心取上清液，即可測定多糖含量［15］。由于真菌細胞壁成分復雜，而且不同的真菌細胞壁成分不同，單一酶法往往不能充分釋放胞內(nèi)多糖，因此實際應用中多采用復合酶法，利用各種酶協(xié)同作用，充分破壞菌體細胞結(jié)構(gòu)，最大限度提高多糖的提取率。

如對紅蘑子實體多糖的酶法提取研究，采用單因素與正交試驗相結(jié)合，優(yōu)化復合酶法提取紅蘑中的粗多糖工藝，其最優(yōu)提取條件酶解3 h、酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的比例3∶1(質(zhì)量比)、pH 5.0，粗多糖得率可達12.0%，與熱水浸提紅蘑子實體多糖得率8%相比，提取率有了較大的提高［16］。張帥等［17］比較了復合酶法與熱水浸提和酸、堿浸提法在猴頭菇子實體多糖提取率的差別，結(jié)果表明復合酶法浸提可大大提高可溶性多糖的浸提率，在2 h內(nèi)，其多糖浸提率可達4.46%，分別是熱水浸提和酸、堿浸提法的1.7、1.3和1.5倍。因此，酶提法不僅可以使多糖的得率大幅度增加，還具有提取條件溫和、提取時間短、對多糖損傷小、雜質(zhì)易除等優(yōu)點;不足之處是酶的價格較高，又容易失活，實驗過程中溫度控制要求嚴格(因酶的最佳溫度在很小的范圍內(nèi)，條件的改變可能導致酶的失活)，且多糖的高級結(jié)構(gòu)可能因酶的作用而改變［18］。

5 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取多糖是利用超聲波空化產(chǎn)生的極大壓力造成真菌細胞壁及整個生物體破裂，同時超聲波產(chǎn)生的刺激效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速真菌胞內(nèi)多糖的釋放、擴散及溶解，因而能很好地提高多糖的提取率。陳小平等［19］利用超聲波輔助法提取林芝胞內(nèi)多糖，在單因素實驗的基礎上，通過響應面分析法優(yōu)化林芝多糖的提取工藝，在最優(yōu)化提取條件下林芝多糖的得率由優(yōu)化前的42%提高到75%。胡斌杰等［20］利用超聲波輔助法對靈芝多糖的提取工藝進行了研究，同時比較了超聲波提取法與熱水浸提法、稀酸浸提、稀堿浸提在靈芝子實體多糖提取率上的差別，結(jié)果表明超聲波最佳提取條件：藥材粒度20目，提取溫度55℃，超聲處理時間20 min，料液比1∶20;超聲提取方法比常規(guī)提取方法具有更大優(yōu)勢，提取時間大大縮短，提取含量比熱水浸提、稀酸浸提、稀堿浸提法分別提高了36.17%、45.45%、39.13%，提取過程溫度也較低，避免了高溫對靈芝多糖分子結(jié)構(gòu)的分解。由此可見，超聲波輔助法具有提取效率高、提取時間短、提取溫度低、多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點，但是超聲輔助提取時間不宜過長，否則會造成糖苷鍵的斷裂而導致提取率降低。

鑒于超聲波輔助提取法存在的不足，有關(guān)學者提出超聲波結(jié)合酶法提取真菌多糖，謝麗源等［21］利用超聲波復合酶法提取桑黃菌絲體多糖，得出超聲波提取優(yōu)化工藝條件為超聲處理時間20 min、料液比1∶25(g/mL)、功率500 W，在此基礎上提取多糖得率為3.356%，在超聲波優(yōu)化結(jié)果基礎上，進一步進行復合酶法處理，酶解最佳提取條件是pH 6.5，酶解溫度50℃，纖維素酶添加量2.5%、果膠酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%，酶解時間120 min，多糖得率為6.619%。由此可見，超聲波輔助酶法較單一超聲波提取真菌多糖有更好的效果，原因可能是超聲波雖然能增加對真菌細胞壁的破碎效果，增加多糖溶出率，但是它不能完全地將細胞壁破碎，而酶的加入正好彌補這一缺陷，對細胞壁進一步的酶解，充分釋放胞內(nèi)多糖。

6 微波輔助提取法

微波法是靠微波電子管發(fā)出的電磁波，感應生電，又轉(zhuǎn)化成分子的動能而發(fā)熱，從而導致細胞內(nèi)的極性物質(zhì)，尤其是水分子，產(chǎn)生大量熱量，使得細胞內(nèi)的溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞，進一步加熱，導致細胞內(nèi)部和細胞壁水分減小，細胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。由于孔洞和裂紋的存在，胞外溶劑容易進入細胞內(nèi)，溶解并釋放胞內(nèi)多糖［14］。宋江峰等［22］考察了微波功率、液固比、浸提時間、提取次數(shù)等單因素對蛹蟲草多糖得率的影響，得出蛹蟲草子實體多糖微波提取最佳工藝參數(shù)：微波功率744.795 W，提取時間4.25 min，液固比31.057 mL/g，結(jié)果表明微波輔助提取較水提法提取時間大大縮短，節(jié)約用水量，并獲得理想的萃取效果。

目前也有不少學者將微波輔助提取法同超聲波輔助提取法、熱水浸提法進行了比較研究，如時東方等［23］分別采用熱水浸提法、微波輔助提取法和超聲提取法提取桑黃菌絲體粗多糖，結(jié)果表明，微波輔助法與熱水浸提法相比，時間大大縮短，提取率是其2倍;與超聲提取法相比，只用一半的時間，提取率提高40%。因此，微波輔助提取法的提取效率最高，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，微波提取技術(shù)主要特點是快速、節(jié)能、節(jié)省溶劑、污染小而且有利于萃取熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，可避免長時間的高溫引起的物質(zhì)分解，特別適用于處理熱敏性組織成分或從天然物質(zhì)中提取有效成分［24］;與超聲波輔助提取法相比，微波雖然在提取率方面優(yōu)于超聲波輔助法，但是微波法有其局限性，即不適于大批量的工業(yè)生產(chǎn)，僅適合實驗室研究，稍高的提取功率都有可能會破壞真菌多糖結(jié)構(gòu)，導致生物活性的降低，而超聲提取法的全過程不需高溫，避免了因高溫對多糖分子結(jié)構(gòu)的破壞，超聲波儀自動化程度更高，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

為了在微波輔助法的基礎上更進一步提高多糖的提取率，超聲波-微波協(xié)同萃取被不少學者應用于真菌胞內(nèi)多糖的提取。周明等［25］采用超聲波-微波協(xié)同萃取靈芝子實體多糖，結(jié)果表明，超聲波-微波協(xié)同萃取法與常規(guī)熱水提取工藝相比，可減少3/4的提取時間、提高26.27%的提取效率，同時還能有效降低用水量，節(jié)約水資源。黃生權(quán)等［26］采用響應面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同萃取法提取靈芝子實體多糖，結(jié)果表明超聲-微波協(xié)同萃取最佳的提取工藝條件為原料用量100 g，微波功率284 W，提取時間12 min，料液比1∶11.6(g/mL);與傳統(tǒng)水浴浸提法相比，超聲-微波協(xié)同萃取法在較短的超聲提取時間下，靈芝多糖的提取率從1.517%提高到了3.27%。超聲-微波協(xié)同萃取法提高了真菌多糖提取率，可能是由于微波的破壁效應、熱效應，超聲波的機械振動作用、空化作用，以及微波和超聲波的協(xié)同作用，使得真菌細胞內(nèi)的多糖成分可以更好地釋放、進入溶劑并充分混合，從而提高提取率。

除了上述6種常用的真菌胞內(nèi)多糖的提取方法外，目前文獻報道的還有超臨界萃取法、膜分離提取法、真空氣流破壁提取法等多種提取方法。根據(jù)某些氣體在超臨界狀態(tài)下具有特殊的液相性質(zhì)，對一些組分有較好的溶解性，用來提取目的產(chǎn)物。一般采用CO2超臨界萃取多糖組分［27］，這種方法對物質(zhì)的生物活性保存較好，但成本較高，大多用于價值較高的多糖的提取。膜分離提取法主要是根據(jù)膜的選擇透過性來分離濃縮真菌胞內(nèi)多糖的，但是膜分離提取法由于操作流程復雜和成本高，因此不常用?；瘜W滲透法主要是利用化學藥品改變細胞壁或膜的通透性，從而使胞內(nèi)多糖有選擇地滲透出來，但鑒于化學試劑的危害性，目前較少采用。

7 展望

國內(nèi)外已從高等擔子菌中篩選到200多種有生物活性的多糖物質(zhì)，目前市場上投放的真菌多糖類保健品已有上百種之多［28］。真菌多糖可應用于人類的疾病治療和保健，對其提取分離工藝的研究可促進食用真菌和藥用真菌的深加工與進一步開發(fā)，但是國內(nèi)外對真菌多糖的高級結(jié)構(gòu)、合成途徑、藥理學機理以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究的不夠深入，因此，有必要在這些方面加大科研投入力度，同時還應該擴大真菌多糖的應用領域，充分挖掘真菌多糖的應用潛能。

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